Генная инженерия
<<  Белковая инженерия Построение множественных выравниваний  >>
Генноинженерные ветеринарные препараты
Генноинженерные ветеринарные препараты
Сельскохозяйственная биотехнология
Сельскохозяйственная биотехнология
Получение трансгенных растений
Получение трансгенных растений
Практический результат
Практический результат
ПЦР продукт
ПЦР продукт
Экспрессионые конструкты
Экспрессионые конструкты
Трансформация
Трансформация
Тотальный гербицид
Тотальный гербицид
Эффективность трансформации
Эффективность трансформации
Верхний ряд
Верхний ряд
Достигнутые результаты
Достигнутые результаты
Цирковирус свиней
Цирковирус свиней
Генотипы ЦВС-2
Генотипы ЦВС-2
Направления работы
Направления работы
Свойства лизирующих ферментов бактериофагов
Свойства лизирующих ферментов бактериофагов
Показания
Показания
Лизирующий фермент
Лизирующий фермент
Активность
Активность
Клонирование
Клонирование
Ген
Ген
Электрофоретический анализ
Электрофоретический анализ

Презентация на тему: «Биотехнологии в СХ». Автор: User. Файл: «Биотехнологии в СХ.ppt». Размер zip-архива: 2683 КБ.

Биотехнологии в СХ

содержание презентации «Биотехнологии в СХ.ppt»
СлайдТекст
1 Генноинженерные ветеринарные препараты

Генноинженерные ветеринарные препараты

Прокулевич В. А., Потапович М.И., Голенченко С.Г., Кудин К.В., Совгир Н.В., Добровольский С.

Белорусский государственный университет Минск - Нарочь, 2012 г.

2 Сельскохозяйственная биотехнология

Сельскохозяйственная биотехнология

Подпрограмма «Сельскохозяйственная биотехнология (растениеводство)», Раздел «ДНК-технологии для сельского хозяйства и здравоохранения» ГП «Инновационные биотехнологии»по заданию № 3/2a «Создать трансгенные растения рапса с геном птичьего интерферона»

Белгосуниверситет Институт биофизики и клеточной инженерии НАН Беларуси НПЦ НАН Беларуси по земледелию

Научные руководители: Прокулевич В.А. Волотовский И.Д. Привалов Ф.И.

3 Получение трансгенных растений

Получение трансгенных растений

Целью работы явилось получение трансгенных растений рапса, включивших в свой геном ген куриного интерферона. При этом необходимо было решить ряд экспериментальных задач: Сконструировать векторы для экспрессии гена куриного интерферона в растениях – БГУ, Институт биофизики и клеточной инженерии НАН Беларуси Создать агробактериальные клоны с геном куриного интерферона –БГУ, Институт биофизики и клеточной инженерии НАН Беларуси Адаптировать агробактериальную систему трансформации in planta для рапса – БГУ, Институт биофизики и клеточной инженерии НАН Беларуси, НПЦ НАН Беларуси по земледелию 4. Получить трансгенные растения рапса, включившие в геном ген куриного интерферона

4 Практический результат

Практический результат

Решение данных задач позволит получить практический результат в виде трансгенных растений, продуцирующих и накапливающих белок куриного интерферона имеющий лечебные и профилактические (антивирусные и иммуномодулирующие) свойства. Предполагается, что на основе таких растений будет создана препаративная форма для профилактики и лечения болезней кур.

5 ПЦР продукт

ПЦР продукт

ПЦР продукт (ген куриного интерферона) амплифицировали с использованием модифицированных праймеров - с добавлением дополнительного сиквенса (CACC), что позволяет использовать данный продукт для pENTR Directional TOPO® Cloning и осуществить встраивание ПЦР продукта в строго заданной ориентации (с эффективностью до 90%), за счет отжига комплементарного участка вектора (GTGG) и стабилизации встраиваемого фрагмента катализируемого Topoisomerase I из Vaccinia virus.

6 Экспрессионые конструкты

Экспрессионые конструкты

В результате реакции рекомбинации (LR-reaction) ?INF-pENTR с бинарным экспрессионным вектором pB7WG2 были получены экспрессионые конструкты по интерферону. Более 95% полученных E. coli DH5? клонов содержали экспрессионный конструкт. Рестрикционный анализ с использованием BamHI показал, что все тестируемые клоны содержат ген интерферона в правильной ориентации.

Полученые экспрессионные клоны были трансформированы при помощи метода электропорации в штаммы Agrobacterium tumefaciens GV3010 (содержащий хелперную плазмиду pMP90RK) и LBA4404 (с модификацией pBBR1MCS-5.virGN54D). Данные штаммы наследуют дополнительные участки, определяющие более эффективное встраивание фрагментов Т-DNA в геном растений.

7 Трансформация

Трансформация

В

А

Трансформация проводилась методом нанесения поранения in planta. Проросткам лезвием наносилось поранение между семядолями через апикальную меристему на 1,5-2 мм до семядольного узла - небольшого утолщения под семядольными листьями, состоящего из меристемной ткани, отвечающей за развитие всех последующих надземных органов растения.

А. Семядольный узел на проростке рапса. Одна семядоля удалена. В. Проросток после поранения Красная стрелка указывает на семядольный узел

8 Тотальный гербицид

Тотальный гербицид

Для селекции трансформантов в качестве селектирующего фактора использовался тотальный гербицид БАСТА. Проводили трехкратную обработку БАСТА из пульверизатора в концентрации 0,1 мл/100 мл воды с промежутком в 10 дней между каждой обработкой.

Трансформированные растения рапса после обработки селективным агентом. Чёрными стрелками обозначены предполагаемые трансформанты, красными – растения, не прошедшие селекционный отбор.

9 Эффективность трансформации

Эффективность трансформации

Для трансформации использовались 7 клонов агробактерий, 4 клона GV3010 (А и С - pB7WG2, и В и D - pB7WG2 с N-терминальным эпитопным StrepII-3xHA тагом) и 3 клона LBA4404 (с дополнительной модификацией VirGN54D Ti-плазмиды) – 1, 2 и 3

Эффективность трансформации рапса «Прамень»

Всего/в среднем

Всего/в среднем

A

B

C

D

1

2

3

Используемые клоны A. tumefaciens

Используемые клоны A. tumefaciens

Используемые клоны A. tumefaciens

Используемые клоны A. tumefaciens

Используемые клоны A. tumefaciens

Используемые клоны A. tumefaciens

Используемые клоны A. tumefaciens

Обработано проростков

436

163

399

120

800

650

515

3083

Получено трансгенных растений

8

31

18

13

107

95

16

288

Среди них стерильных

0

2

0

0

3

1

1

7

Эффективность трансформации, %

1,8

19

4,5

10,8

13

14,6

3,1

9,5

10 Верхний ряд

Верхний ряд

Верхний ряд: 1-5 - ДНК, выделенная из листьев клонов рапса №№ 167-171, 6,7 – клетки Agrobacterium, используемые для трансформации, 8 – положительный контроль (используемая плазмида с геном куриного интерферона), 9 – отрицательный контроль, 10 – ladder. Нижний ряд: 1-9 – ДНК, выделенная из листьев клонов рапса №№ 94-99, 164-166, 10 – ladder (снизу вверх: 100, 200, 300, 400, 500 п. н. и т.д.);

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11 Достигнутые результаты

Достигнутые результаты

Достигнутые результаты: 1. Сконструированы плазмиды: - pB7WG2 – экспрессионный вектор с геном куриного интерферона, предназначенный для трансформации в растения. pB7WG2 StrepII-3xHA – экспрессионный вектор, где ген куриного интерферона, модифицированный таговой последовательностью, позволяющей отслеживать уровень синтеза целевого белка и осуществлять его очистку из растительного материала. 2. Получено 7 клонов агробактерий: 4 клона GV3010 (А и С - pB7WG2, и В и D - pB7WG2 с N-терминальным эпитопным StrepII-3xHA тагом) и 3 клона LBA4404 (с дополнительной модификацией VirGN54D Ti-плазмиды) 3. Получено 288 трансгенных растений рапса сорта «Прамень», устойчивые к селективному агенту гербициду «БАСТА» и 14 растений, показавших положительный ответ в ПЦР-анализе.

12 Цирковирус свиней

Цирковирус свиней

Цирковирус свиней типа 2 (ЦВС-2)

13 Генотипы ЦВС-2

Генотипы ЦВС-2

«Американский» генотип

«Европейский» генотип

(представлен в Беларуси)

14 Направления работы

Направления работы

Разработка вакцины Разработка диагностических наборов ИФА ПЦР Стандартная ПЦР ПЦР в реальном времени

15 Свойства лизирующих ферментов бактериофагов

Свойства лизирующих ферментов бактериофагов

Высоко специфичны

Высоко активны

Действуют на консервативную мишень – клеточную стенку

Обладают бактерицидным действием

Вещества белковой природы

Обладают выраженной доменной структурой

Действуют только против одного или нескольких близкородственных видов бактерий, не затрагивая нормальную микрофлору.

Рабочие дозы – несколько мкг/кг. Действуют быстро, за минуты.

Нет различий в чувствительности у различных штаммов одного вида. Низка вероятность возникновения устойчивых штаммов.

Идеально подходят для пациентов с иммунодепрессивными состояниями

Не токсичны, легко метаболизируются и выводятся. Производство не связано с крупными экологическими издержками.

Удобно для создания не существующих в природе химерных энзимов с заданным спектром антибактериальной активности.

16 Показания

Показания

Показания: Лизоцимы применяется для лечения и профилактики гнойных инфекций кожи, слизистых, висцеральных органов, вызванных стафилококками или стрептококками, а также при дисбактериозах

Заболевания уха, горла, носа, дыхательных путей и легких (синусит, отит, ангина, фарингит, ларингит, трахеит, бронхит, пневмония, плеврит); хирургические инфекции (гнойные раны, инфицированные ожоги, абсцесс, флегмона, фурункул, карбункул, гидраденит, панариций, инфильтрированный и абсцедировавшийся стафилококковый сикоз, парапроктит, мастит, бурсит, тендовагинит, остеомиелит); урогенитальная патология (уретрит, цистит, пиелонефрит, кольпит, эндометрит, сальпингоофорит); энтеральная патология (гастроэнтероколит, холецистит, дисбактериоз кишечника); генерализованные септические заболевания; гнойно-воспалительные заболевания новорожденных (омфалит, гастроэнтероколит, сепсис); другие заболевания стафилококковой или стрептококковой этилогии; профилактика гнойных процессов при свежеинфицированных ранах (операции брюшной и грудной полости, уличный и производственный травматизм и др.); Для профилактики внутрибольничных инфекций по эпидемическим показаниям.

17 Лизирующий фермент

Лизирующий фермент

Лизирующий фермент стафилококкового бактериофага К

Доменная структура LysK

Пептидогликан Staphylococcus aureus

Фотография бактериофагов семейства Myoviridae

CHAP – cysteine, histidine-dependent amidohydrolase/ peptidase (наиболее активный домен)

18 Активность

Активность

Активность LyzK 174

T1/2 = NA

Исследованные штаммы: S. aureus 141 S. aureus 142 S. aureus 143 S. aureus 144 S. aureus 367 S. aureus 388 Не различались по чувствительности

S. Aureus 141 ОП600 50U lyz174

T1/2 = 0,8’

S. aureus 141 ОП600 контроль

19 Клонирование

Клонирование

Клонирование и экспрессия гена антимикробного белка эскулентина в составе гибридной генетической последовательности в клетках бактерий escherichia coli

Катионный АМП эскулентин-1b (Esc-1b) из кожных секретов прудовой лягушки (Rana esculenta), состоит из 46 аминокислотных остатков и характеризуется наличием семичленного С-терминального кольца, которое стабилизируется дисульфидным мостиком между Cys40 и Cys46. Анализ данного пептида показал, что его активность в отношении грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов обусловлена линейной N-концевой областью с первой аминокислотной позиции по восемнадцатую (GIFSKLAGKKLKNLLISG-NH2) - Esc (1-18), которая обладает таким же положительным зарядом (+5) как полноразмерный пептид.

Действие Esc (1-18) в МИК 32мкМ на клетки E. coli ATCC 25922 (4?107 КОЕ/мл) по данным просвечивающей электронной микроскопии. A – контроль (клетки не обработанные Esc (1-18)), B – результат действия через 5 мин, C – результат действия через 20 мин (Marcellini et al., 2009)

20 Ген

Ген

Ген, кодирующий белок Esc-1b, был клонирован в клетках E. coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL. Однако последующая экспрессия гена и проведенный электрофоретический анализ белков в Tricine-SDS-PAGE не выявил накопления целевого продукта по массе равного 4,8 кДа. Согласно литературным данным экспрессия АМП в клетках E. coli связана с рядом трудностей: во-первых, они могут деградироваться клеточными протеазами, а во-вторых, токсичны для клеток, в которых экспрессируются. В качестве партнера Esc-1b был выбран пептидазный домен лизирующего фермента бактериофага К длиной 165 аминокислотных остатков (LyzK) и массой 18,6 кДа, который хорошо экспрессируется в клетках E. coli и формирует тельца включения, а также известен своей выдающейся антистафилококковой активностью.

Экспрессия клонированной гибридной последовательности, предположительно, должна приводить к образованию белка, на N-конце содержащего Esc-1b, на С-конце – LyzK165.

21 Электрофоретический анализ

Электрофоретический анализ

Индукцию экспрессии клонированного гена проводили в среде ZYM-5052 для автоиндукции. Проведенный электрофоретический анализ белков в SDS-PAGE показал образование продукта N-Esc-1b-LyzK165-C массой 23,4 кДа.

Дорожки: 1, 2, 3 – pET-24b(+)-Esc-1b/LyzK165 (штаммы 1, 2, 3 соответственно) 4 – pET-24b(+)-LyzK165 (положительный контроль) 5 – pET-24b(+) (отрицательный контроль) 6 – белки-стандарты молекулярных масс Fermentas SM0431 (сверху вниз: 116 кДа, 66,2 кДа, 45 кДа, 35 кДа, 25 кДа, 18,4 кДа, 14,4 кДа)

«Биотехнологии в СХ»
http://900igr.net/prezentacija/biologija/biotekhnologii-v-skh-58760.html
cсылка на страницу
Урок

Биология

136 тем
Слайды