Генетика
<<  Генетический анализ Пол Кругман  >>
Генетический анализ
Генетический анализ
Генетические задачи решаются легко только тогда, когда они
Генетические задачи решаются легко только тогда, когда они
Вопросы
Вопросы
Метод гибридизации соматических клеток
Метод гибридизации соматических клеток
Немного из истории генетики соматических клеток
Немного из истории генетики соматических клеток
Основные характеристики и свойства соматических гибридов
Основные характеристики и свойства соматических гибридов
Преимущества в использовании метода гибридизации соматических клеток
Преимущества в использовании метода гибридизации соматических клеток
Основные черты гибридов соматических клеток и этапов анализа
Основные черты гибридов соматических клеток и этапов анализа
Основные черты гибридов соматических клеток
Основные черты гибридов соматических клеток
Типы гибридов соматических клеток и их использование
Типы гибридов соматических клеток и их использование
Типы гибридов соматических клеток и их использование
Типы гибридов соматических клеток и их использование
Клеточные линии
Клеточные линии
Понятие клеточной линии
Понятие клеточной линии
Понятие клеточной линии
Понятие клеточной линии
Методы получения микроклеток
Методы получения микроклеток
Методы слияния клеток
Методы слияния клеток
Методы слияния клеток
Методы слияния клеток
Слияние с использованием химических агентов
Слияние с использованием химических агентов
Слияние с использованием электрошока
Слияние с использованием электрошока
Методы селекции клеточных гибридов
Методы селекции клеточных гибридов
Методы селекции клеточных гибридов
Методы селекции клеточных гибридов
Методы селекции клеточных гибридов
Методы селекции клеточных гибридов
Методы селекции клеточных гибридов
Методы селекции клеточных гибридов
Неселективные методы выделения клеточных гибридов
Неселективные методы выделения клеточных гибридов
Цитогенетический анализ синкарионов и картирование генов
Цитогенетический анализ синкарионов и картирование генов
Подходы для определения группы сцепления
Подходы для определения группы сцепления
Подходы для определения группы сцепления
Подходы для определения группы сцепления
Подходы для определения группы сцепления
Подходы для определения группы сцепления
Методы субхромосомного картирования генов
Методы субхромосомного картирования генов
Субхромосомное картирование генов
Субхромосомное картирование генов
Гибридизация по Д. Коксу 1990 г
Гибридизация по Д. Коксу 1990 г
Гибридизация по Д. Коксу 1990 г
Гибридизация по Д. Коксу 1990 г

Презентация: «Генетический анализ». Автор: Aleksey V. Lahodzich. Файл: «Генетический анализ.pps». Размер zip-архива: 232 КБ.

Генетический анализ

содержание презентации «Генетический анализ.pps»
СлайдТекст
1 Генетический анализ

Генетический анализ

Лекция 6

2 Генетические задачи решаются легко только тогда, когда они

Генетические задачи решаются легко только тогда, когда они

предварительно уже решены другими. Поэтому необходимо предостеречь тех, кто впервые приступает к генетическому анализу, от уныния и пессимизма, если их первые попытки окажутся неудачными. Александр Сергеевич Серебровский

3 Вопросы

Вопросы

1. Использование метода гибридизации соматических клеток в генетическом анализе. Типы гибридов соматических клеток и их использование Клеточные линии. Методы получения цитопластов и кариопластов . Методы получения микроклеток. Методы слияния клеток . Методы селекции клеточных гибридов . Цитогенетический анализ синкарионов и картирование генов. Методы субхромосомного картирования генов.

4 Метод гибридизации соматических клеток

Метод гибридизации соматических клеток

5 Немного из истории генетики соматических клеток

Немного из истории генетики соматических клеток

Гибридизация соматических клеток – это один из сравнительно молодых и эффективных методов определения локализации генов в хромосомах эукариот.

Важным этапом для развития генетики соматических клеток было обнаружение того факта, что соматические клетки организма при переводе их в культуру ведут себя сходным образом с культурами клеток микроорганизмов. В 1965 году английский ученый Г. Харрис впервые получил гетерокарионы, образованные клетками мыши и человека. Первый межвидовой растительный гибрид был получен в 1972 году П. Карлсоном (США) при слиянии протопластов из клеток разных видов табака. Подобного рода искусственную гибридизацию можно осуществлять между соматическими клетками, принадлежащими далеким в систематическом отношении организмам и даже между растительными и животными клетками. Гибридизация соматических клеток животных сыграла важную роль в исследовании генетических процессов: механизмов реактивации генома покоящейся клетки; степени фенотипического проявления отдельных генов; клеточного деления; в картировании генов в хромосомах человека; в анализе причин злокачественного перерождения клеток. В число объектов изучения с помощью генетики соматических клеток вошли насекомые, рыбы, амфибии, птицы и разнообразные млекопитающие, а также высшие растения.

6 Основные характеристики и свойства соматических гибридов

Основные характеристики и свойства соматических гибридов

Гибриды, полученные при слиянии протопластов, имеют существенно важное отличие от гибридов, полученных при слиянии половых клеток, поскольку несут цитоплазму обоих родителей. Возможно создание цибридов, наследующих ядерные гены одного из родителей наряду с цитоплазматическими генами обоих родителей. Особый интерес представляют цибриды растений, несущие цитоплазматические гены устойчивости к различным патогенам и стрессорным факторам, полученные от дикорастущих видов, или цитоплазматические гены мужской стерильности. Кроме того, метод гибридизации клеток может быть использован и используется для создания новых хозяйственно-ценных сортов за счет сочетания в гибридных клетках полезных признаков каждого из родительских типов. При помощи слияния соматических клеток создают и новые клеточные линии-продуценты важных соединений, в частности, антител.

Характеристики, позволяющие использовать соматические клетки и их гибриды в генанализе Культура соматических клеток отвечают всем трем условиям, необходимым при изучении наследственности: - получение потомства от одной отдельно взятой особи; - возможность гибридизации; - расщепление родительских признаков в потомстве гибридов.

7 Преимущества в использовании метода гибридизации соматических клеток

Преимущества в использовании метода гибридизации соматических клеток

Генетический анализ организмов, осуществляемый с привлечением метода гибридизации соматических клеток лишен ряда недостатков, характерных для традиционных методов генетического анализа, таких как гибридизация либо локализация генов по проявлениям признаков у особей с дефектными хромосомами, анализ родословных, данных о совместном наследовании какого-либо признака и аномальных хромосом в семьях. В особенности это утверждение справедливо применительно к млекопитающим, имеющим ограничения для стандартных методов генанализа и, в частности, к человеку. К таким ограничениям относятся: - длительность времени генерации; - малая плодовитость, что и объясняет большую трудоемкость подобной работы наряду с низкой результативностью, и как следствие – низкая интенсивность использования. Сходство культур соматических клеток с клеточными культурами микроорганизмов позволяет применять к ним методы, разработанные при изучении фагов и бактерий. Все вариации метода гибридизации клеток можно разделить на два основных направления: слияние клеток разных видов и слияние клеток одного вида.

8 Основные черты гибридов соматических клеток и этапов анализа

Основные черты гибридов соматических клеток и этапов анализа

Возможно слияние не только клеток одного вида, но и разных видов, в том числе значительно удаленных друг от друга в систематическом плане: мышь?человек, мышь?крыса, крыса?человек, человек?китайский хомячок и др. В результате образуются клетки, содержащие два ядра обоих видов – гетерокарионы. Гетерокарионы далее либо погибают, либо, просуществовав определенное время в культуре, образуют одноядерные гибридные клетки – синкарионы. Эти клетки могут размножаться какое-то время в культуре, при этом от пассажа к пассажу происходит случайная элиминация части хромосом, причем преимущественно теряются, как правило, хромосомы одного из видов. Например, в гибридах «крыса?человек» – крысы; в гибридах «человек?китайский хомячок» – преимущественно человека; в гибридах «мышь?человек» – преимущественно человека. В среднем после 6-го пассажа в гибридах оказывается около 20% человеческого генома (по сравнению с исходными 50%). Клеточная линия, хромосомы которой утрачиваются, называется донорной, другая – реципиентной. В результате гибридные клетки человека и мыши содержат более или менее полный хромосомный набор мыши и различные (в среднем 5-7) хромосомы человека, причем в разных клонах – разные. Хромосомы человека легко отличимы визуально при использовании дифференциального окрашивания.

9 Основные черты гибридов соматических клеток

Основные черты гибридов соматических клеток

Последующие этапы анализа гибридов включают: селекцию гибридных клеток и избавление от родительских клеток; анализ проявления тех или иных признаков у клонов с определенным набором хромосом и отнесение генов, отвечающих за данный признак, к той или иной группе сцепления в соответствии с результатами проведенного анализа. Очевидно, что особенно ценны для такого вида анализа клоны, содержащие лишь одну из хромосом человека – наличие того или иного человеческого фермента в этом случае фактически однозначно свидетельствует о локализации соответствующих генов в этой хромосоме человека. В случае гибридизации клеток одного или 2-х близкородственных видов элиминации хромосом не наблюдается либо она происходит с очень медленной скоростью. Такая гибридизация может быть использована для анализа характера межаллельных взаимодействий. Так, посредством слияния трансформированных клеток человека с клеточной линией нормального фенотипа (генотипа) были обнаружены гены-суппрессоры опухолевой трансформации, работающие в нормальных клетках и обладающие доминантным эффектом. По результатам картирования такие гены присутствовали на 1, 3, 4, 5, 6, 9, 11, 13 и 22 хромосомах человека.

10 Типы гибридов соматических клеток и их использование

Типы гибридов соматических клеток и их использование

В зависимости от целей исследования и характера сливаемых клеток можно получать различные варианты соматических гибридов: Гибриды – продукты слияния двух целых клеток; Продукты гибридизации микроклеток (клеток с небольшим количеством хромосом) с целыми клетками; Цибриды – продукты слияния энуклеированных клеток (цитопластов), с целыми клетками; полученные цибриды будут содержать ядро одной из родительских клеток, а цитоплазму обоих. Продукты гибридизации миниклеток, или кариопластов (то есть клеток, содержащих ядро с полным набором хромосом и минимальное количество цитоплазмы) с целыми клетками; в результате образуются клетки, сочетающие в себе ядерный геном обоих родительских клеток, а цитоплазму только одной из них. Как вариант может быть гибридизация цитопластов одной родительской линии с кариопластами другой. Радиационные гибриды – образуются путем слияния целых клеток с клетками, обработанными Х-облучением, которое вызывает фрагментацию хромосом.

11 Типы гибридов соматических клеток и их использование

Типы гибридов соматических клеток и их использование

Получение гибридов целых клеток и продуктов гибридизации микроклеток с целыми клетками направлено, прежде всего, на установление локализации ядерных генов, а также на определение характера взаимодействия между ними. Получение и изучение следующих двух вариантов гибридных клеток (цибрид и продуктов гибридизации кариопластов с целыми клетками) направлено главным образом на выявление цитоплазматических факторов наследственности, а также характера взаимодействия между ядерными и цитоплазматическими генами. Получение таких гибридов наиболее актуально для генетики высших растений. Так было изучено явление цитоплазматической мужской стерильности, цитоплазматическое наследование таких признаков, как устойчивость к различным патогенам и стрессорным факторам у растений. Эти методы также позволили сделать вывод о регулировании экспрессии и репликации ядерных генов цитоплазматическими факторами. Получение и использование радиационных гибридов позволяет картировать ген внутри конкретной области хромосомы по совместному наследованию с другим известным маркером в той же области. Следует заметить одно общее правило: чем меньше количество передаваемой информации, тем выше специфичность ее действия. Каждый из перечисленных способов передачи информации включает ряд дополнительных методик: методика высокоэффективного слияния клеток, разработка методов для селекции полученных гибридов, методика энуклеации для получения цитопластов и кариопластов, методика получения микроклеток и др.

12 Клеточные линии

Клеточные линии

13 Понятие клеточной линии

Понятие клеточной линии

Исходные линии клеток

Клеточная линия – I) клетки, полученные от многоклеточного первичного экспланта, которые культивируются in vitro путем пассирования (пересевов), поддерживая их в размножающемся состоянии; II) клетки, полученные из первичной культуры или клеточной линии путем отбора и клонирования клеток, имеющих определенные свойства или маркеры, которые должны сохраняться в течение последующего культивирования.

Исходные клеточные линии Может быть использована: культура клеток-предшественниц, выращиваемых на соответствующей среде; либо клетки могут быть получены путем разделения клеток ткани, например, трипсином. Клетки растят на донышке пластиковых чашек Петри под слоем среды. Большинство клеток для своего роста нуждаются в адгезии к субстрату. Клетки делятся до определенной плотности, вследствие контактного ингибирования, поэтому необходим периодический пересев клеток на свежую среду. Число делений человеческих клеток-предшественниц ограничено 50-100, после этого клетки замедляют рост, вакуолизируются и проявляют другие признаки деградации. Мышиные клетки- предшественницы также стареют. Однако трансформированные клетки становятся потенциально бессмертными. Индуцировать трансформацию клеток можно посредством обработки их определенными агентами, имеющими различную природу: - физическую (Х-лучи); химическую (алкилирующие агенты); биологическими (онкогенные вирусы).

14 Понятие клеточной линии

Понятие клеточной линии

Исходные линии клеток

Также неопластические клетки можно получить из опухолей или лимфом больных животных. Существуют стандартные клеточные линии, происходящие от неопластических клеток определенной особи. Они имеют определенное кодовое название и декларированные характеристики, например СНО – культура клеток рака яичников китайского хомячка. Основные свойства трансформированных клеток Помимо бессмертия (неограниченного числа клеточных делений), трансформированные клетки отличаются от нормальных еще рядом особенностей: меньшая требовательность к наличию в среде ростовых факторов; утрата контактного ингибирования; утрата зависимости от адгезии; утрата признаков дифференцировки; часто генотипическая и кариотипическая гетерогенность и нестабильность.

15 Методы получения микроклеток

Методы получения микроклеток

Методы получения цитопластов и кариопластов

Все методы разделения цитопластов и кариопластов включают воздействие на клетки центробежной силы с одновременной обработкой их цитохалазином В. Цитохалазины – это продукты метаболизма грибов, способные подавлять цитокинез, разрушая актиновые филаменты. Клетки во время центрифугирования прикреплены к специальной подложке, помещаемой в центрифужную пробирку. Центрифугирование производится на 10000-30000 g в течение 15-60 мин. При этом более плотные ядра выталкиваются из менее плотной цитоплазмы и оседают на дно пробирки, образуя фракцию кариопластов. Цитопласты остаются прикреплёнными к подложке.

Для получения микроклеток исходную линию клеток (человеческие клетки) подвергают обработке колхицином, который ингибирует формирование митотического веретена. Ядерная мембрана формируеся заново вокруг случайного набора хромосом, образуя микроядра, содержащие одну-несколько хромосом. Далее эти микроядра отделяются от цитопластов таким же образом, как описано выше для целых клеток. Фракция кариопластов, отделившаяся после центрифугирования с цитохалазином В и будет представлять собой массу микроклеток. Надо заметить, что для слияния клеток с цитопластами, кариопластами и микроклетками подходит только вирус Сендай, другие методики слишком агрессивны по отношению к этим типам клеток.

16 Методы слияния клеток

Методы слияния клеток

17 Методы слияния клеток

Методы слияния клеток

Слияние клеток с помощью вируса Сендай

Спонтанное слияние клеток в культуре случается, но с очень низкой частотой, и не может быть использовано в опытах по гибридизации. Существует ряд агентов и способов стимулировать слияние соматических клеток в культуре. Все эти агенты можно разделить на: биологические – с помощью миксовирусов (вирус Сендай); химические – с помощью мембрано-активных веществ (ПЭГ, ДМСО); физические – электростимуляция.

Эффективный метод слияния клеток. Преимущества вируса Сендай как сливающего агента заключаются в практически полном отсутствии цитотоксического эффекта, недостатки – в необходимости наращивать, титровать, концентрировать и инактивировать вирус, а также в неприменимости данного метода слияния к клеткам растений и грибов, которые не имеют рецепторов к вирусу Сендай. Наращивание производится в аллантоисной жидкости куриного эмбриона на протяжении 3-х суток. Концентрирование – путем центрифугирования 30 мин. при 50000 g и затем ресуспендирования осажденных вирусных частиц в небольшом объемом раствора Хэнкса. Хранят небольшими порциями в замороженном виде. Инактивацию вируса производят непосредственно перед проведением гибридизации посредством облучения вирусных частиц ультрофиолетом (при обработке чашки Петри с жидкостью, содержащей вирус выдерживаются в течении 5 мин. на расстоянии 15 см от ультрафиолетовой лампы для стерилизации). При этом вирус теряет способность к размножению, но сохраняет способность сливать клетки.

18 Слияние с использованием химических агентов

Слияние с использованием химических агентов

Полиэтиленгликоль (ПЭГ) был впервые применен как сливающий агент к растительным клеткам в 70-х годах. Вскоре было показано, что полиэтиленгликоли с молекулярной массой 1000-6000 успешно сливают клетки животных. Главный недостаток ПЭГ – высокая токсичность. Время контакта клеток с 50% раствором ПЭГ не может превышать 1 мин. Повышение рН раствора ПЭГ до 7,8-8,0 повышает частоту слияния клеток. Для снижения токсичности в раствор в некоторых случаях добавляют 10% диметилсульфоксид (ДМСО), снижая при этом концентрацию ПЭГ до 35%. Еще один путь снижения токсичности ПЭГ – использование бескальциевой среды. Для перевода из суспензии в монослой плохо адгезирующихся клеток, что бывает необходимо для проведения цитогенетического анализа, используют осаждение центрифугированием, и в качестве прикрепительного субстрата используют пластик покрытый конкавалином А.

19 Слияние с использованием электрошока

Слияние с использованием электрошока

Данный метод получил очень широкое распространение. Он основан на электропробое мембран двух клеток в месте их контакта. Предварительное сближение клеток может быть осуществлено разными способами: - механически с помощью микроигл, - путем соосаждения в центрифужной пробирке, - путем совместной посадки клеток в плотный монослой, - с помощью агглютинации клеток лектинами и др. Электропробой предпочтительно проводить в бескальциевой среде. Существуют самые различные вариации данного метода. При электрослиянии разрешаются 2 важные задачи: преимущественное получение двуядерных гибридов при слиянии; снижение гибели клеток при слиянии. С помощью электрошока удается слить до 80% клеток в препарате. Слияние клеток всеми перечисленными методами возможно как в суспензии, так и в монослое. Во всех случаях, когда предполагается цитологическое исследование гетерокарионов, оптимальным является слияние клеток в монослое. В тех же случаях, когда необходимо получить клоны гибридных клеток (например, при получении гибридом, продуцирующих антитела), лучше использовать методы слияния клеток в суспензии, позволяющие сливать очень большие количества клеток-партнеров (десятки и сотни миллионов).

20 Методы селекции клеточных гибридов

Методы селекции клеточных гибридов

21 Методы селекции клеточных гибридов

Методы селекции клеточных гибридов

Для разделения клеточных линий, или отделения гибридных клеток от родительских могут быть использованы различия по генетическим маркерам, таким, как: - поверхностные антигены; - поверхностные рецепторы к токсинам; - электрофоретические варианты ферментов; - полиморфизм сайтов рестрикции; - устойчивость к аналогам пуриновых/пиримидиновых оснований - температурная чувствительность. - устойчивость к антибиотикам, например, к G418 и др. Гибридные клетки изначально содержат полные хромосомные наборы родительских клеток и обычно совмещают большинство, а иногда все характеристики обоих родительских клеточных типов. Методы выделения гибридных клеток можно разделить на селективные и неселективные. Селективное выделение заключается в культивировании смеси клеток, содержащих как родительские, так и гибридные клетки в условиях, при которых выживают только гибридные клетки. В 60-70-х годах был предложен ряд систем селекции гибридных клеток, основанных на использовании для слияния линий клеток, имеющих генетические дефекты, в основном, связанные с ауксотрофностью по какому-либо метаболиту (аминокислота, углевод, нуклеотид), являющемуся селективным веществом. Могут быть использованы и температурно-чувствительные мутанты. Мутации в исходных линиях могут быть спонтанно возникшими или индуцированными с помощью мутагенных факторов. Далее следует отбор мутантов для проведения гибридизации.

22 Методы селекции клеточных гибридов

Методы селекции клеточных гибридов

Очень распространено использование селективной среды ГАТ, содержащей гипоксантин – предшественник пуринов, аминоптерин – ингибитор внутриклеточного синтеза нуклеиновых оснований, и тимидин. Исходные родительские линии получают путем селекции исходных линий на устойчивость к аналогам нуклеиновых оснований: одна линия выращивается на среде с 8-азагуанином. При этом устойчивый фенотип приобретают клетки с утраченной активностью фермента гипоксантингуанинфосфотрансферазы (ГКФТФ-). Такие клетки не могут усваивать из среды гипоксантин и превращать его в пуриновые основания. Другая линия выращивается на среде с 5-бромодезоксиуридином. При этом устойчивый фенотип приобретают клетки с утраченной активностью фермента тимидинкиназы (ТК-). Такие клетки не могут усваивать из среды тимидин. Таким образом, на среде ГАТ смогут выживать только гибридные клетки, получившие активные ферменты от каждой из родительских клеток (ГКФТФ+ ТК+). Могут быть использованы родительские линии, каждая из которых проявляет естественную или приобретенную устойчивость к определенному химическому веществу, например, к антибиотику или токсину. Гибридные клетки, объединяя в себе свойства обоих родителей, смогут выжить на среде, где содержатся сразу два биохимических ингибитора, в то время, как родительские клетки на такой среде будут погибать.

23 Методы селекции клеточных гибридов

Методы селекции клеточных гибридов

В связи с необходимостью получения гибридов из первичных клеток большое значение имеет разработка систем селекции клеточных гибридов, которые позволили бы основываться на естественных свойствах исходных клеток. К примеру, дифтерийный токсин является биохимическим ингибитором только в отношении человеческих клеток, имеющих рецепторы к нему. На клетки же мыши, не имеющие таких рецепторов, он не действует. Здесь можно добавить еще несколько методов: 1. Селекция методом «токсин-антитоксин» - этот метод основан на предварительном введении в клетки-партнеры антител к двум различным токсинам (например к рицину и к дифтерийному токсину) и на последующем выживании гибридов на среде с этими токсинами, так как они несут антитела против них обоих. 2. Селекция методом интерферон – вирус. Метод разработан на человеческих клетках и на мышиных клетках. Он основан на защите гибридных клеток от вируса (селективный агент) с помощью видоспецифических интерферонов. В среду со смесью клеток добавляют мышиный интерферон, затем вирус везикулярного стоматита. При этом гибнут только человеческие клетки, не имеющие рецепторов к мышиному интерферону. Затем клетки отмывают и добавляют среду с человеческим интерфероном. При последующем добавлении вируса гибнут клетки мыши. Гибридные же клетки, имеющие рецепторы к обоим типам интерферонов, выживают.

24 Неселективные методы выделения клеточных гибридов

Неселективные методы выделения клеточных гибридов

К неселективным методам выделения гетерокарионов можно отнести методы флюоресценции и проточной цитометрии. Родительские клетки могут метиться флюоресцентными маркерами с разной длиной волны испускаемого излучения. Для прижизненной маркировки клеток используют флюоресцирующие полистироловые гранулы, фагоцитируемые клетками, либо флюоресцирующие липидные молекулы, которые в процессе инкубации проникают в клетки через мембрану. После гибридизации, клетки, различающиеся по спектру излучения, могут быть разделены в проточном цитофлюориметре-сортере. Кроме того, метод проточной цитометрии может быть совмещен с мечением клеток специфическими антителами, связывающимися с поверхностными антигенами родительских и гибридных клеток. Такие антитела могут быть химически связаны с флюоресцентными маркерами. Колонии гибридных клеток появляются через 2 недели после их рассева.

25 Цитогенетический анализ синкарионов и картирование генов

Цитогенетический анализ синкарионов и картирование генов

26 Подходы для определения группы сцепления

Подходы для определения группы сцепления

Как правило, для картирования генов человека производят слияние фибробластов человека с транформированными клетками мыши или китайского хомячка. Это делает гибридные клетки потенциально бессмертными. В то же время в процессе клеточных делений происходит случайная элиминация части человеческих хромосом, и в результате после n-числа пассажей получают синкарионы, содержащие всего одну либо несколько хромосом человека. Это значительно упрощает картирование генов на хромосомах. Для определения группы сцепления, или синтенной группы (хромосомы), к которой относится исследуемый ген, существует 3 основных подхода: Селективное сохранение – выживание на селективой среде тех гибридов, у которых присутствуют нужные хромосомы содержащие необходимые для выживания на этой среде гены. Субкультивируют гибриды, затем получают клоны и исследуют их на способность расти на этой среде. Проверяют, какие хромосомы присутствуют или отсутствуют у изучаемых клонов. Так, для гибридов человек ГКФТФ- х мышь ТК- единственная хромосома человека, почти всегда (почти – из-за возможных транслокаций) присутствующая у гибридов, выживающих на среде ГАТ, - 17-я хромосома. Следовательно, ген ТК у человека находится на 17-й хромосоме. Так же определили, что ген ГКФТФ находится на Х хромосоме человека. При гибридизации клеток китайского хомячка, ауксотрофных по пурину с человеческими клетками на среде без пуринов растут только гибриды, содержащие человеческую 21-ю хромосому, на которой находится ген фермента ГАРТ, участвующий в синтезе пуринов. С другой стороны, на среде, содержащей дифтерийный токсин, растут только гибридные клетки с утраченной 5-й хромосомой, из чего можно сделать вывод, что именно на ней локализован ген рецептора к дифтерийному токсину.

27 Подходы для определения группы сцепления

Подходы для определения группы сцепления

2. Неселективное определение передачи гена. Белки человека могут отличаться от гомеологичных мышиных по подвижности при гель-электрофорезе, таким образом можно отличить клетки, несущие человеческую аллель соответствующего гена. Например, этот способ использовался для определения локализации гена фосфоглюкомутазы (ФГМ). Другой способ выявить человеческую форму продуцируемого белка – использование специфических антител. Субкультивируют клетки, получают клоны. Проверяют, какие из них продуцируют человеческую форму белка, и какие хромосомы присутствуют. Обнаружили, что единственная хромосома, почти всегда присутствующая, когда присутствует человеческий фермент ФГМ, - 1-я. Для выявления экспрессии человеческих генов могут, кроме того, использоваться молекулярные методы, например, методы гибридизации РНК. 3. Определение синтенности маркеров. В этом случае не требуется рассматривать хромосомы гибридов. Локализация изучаемого гена определяется по сонаследованию с теми или иными известными человеческими маркерами, характерными для каждой из хромосом. Для точного картирования необходима серия клонов, где каждый хромосомный маркер присутствует как минимум в одном из клонов, и как минимум в одном клоне отсутствует. Для определения сонаследования маркеров используются такие понятия, как: - «конкордантность», означающее, что изучаемый и хромосомный маркеры либо оба присутствуют, либо оба отсутствуют в определенной клеточной линии (когда гены относятся к одной синтенной группе, то есть находятся на одной хромосоме); - «дискордантность», означающее что первый может отсутствовать в присутствии второго и наоборот (разные синтенные группы).

28 Подходы для определения группы сцепления

Подходы для определения группы сцепления

Наилучшим подходом для картирования генов на хромосомах является получение монохромосомных гибридов, то есть гибридов, содержащих только одну человеческую хромосому, посредством слияния мышиных (или других) клеток с микроклетками, полученными из человеческой культуры. Присутствие или отсутствие изучаемого гена в монохромосомном гибридном клоне с определенным хромосомным маркером однозначно говорит о том, принадлежит ли ген к соответсвующей синтенной группе. Именно так, получая монохромосомные гибриды опухолевых и нормальных клеток, установили локализацию некоторых суппрессоров опухолей, наследуемых по доминантному типу.

29 Методы субхромосомного картирования генов

Методы субхромосомного картирования генов

30 Субхромосомное картирование генов

Субхромосомное картирование генов

Для субхромосомного картирования генов могут использоваться дополнительные методы: 1). Анализ наследования признаков при наличии в человеческих гибридных клетках визуально определимых делеций и траслокаций на хромосомах. 2). Использование радиационных гибридов, содержащих фрагментированную ДНК. При проведении генетического анализа гибридов оценивают частоту сонаследования изучаемого гена с известными вторичными генетическими маркерами локализованными в определенных областях хромосом. В этом методе можно выделить 2 варианта: а) гибридизация клеток производится после того, как целые клетки либо микроклетки из человеческой линии подвергаются облучению. б) гибридизация по Коксу, основанная на облучениии монохромосомных гибридов и последующей вторичной гибридизации.

31 Гибридизация по Д. Коксу 1990 г

Гибридизация по Д. Коксу 1990 г

В 1990 г. Дэвид Кокс разработал новый подход к картированию, основанный на облучении монохромосомных гибридов. Они могут быть получены посредством выращивания синкарионов мышиных и человеческих клеток на селективной среде, способствующей сохранению изучаемой хромосомы, либо посредством гибридизации мышиных клеток с микроклетками, содержащими человеческую хромосому, меченную селективным маркером, таким, например, как neo – ген устойчивости к неомицину. Эти гибриды обрабатывают кольцемидом и облучают высокой дозой радиации (6500-8000 рад), что приводит к фрагментации хромосом. Далее эти клетки или полученные из них микроклетки гибридизуют с линией клеток китайского хомячка, несущих какой-либо селективный маркер. Гибриды культивируют на селективной среде до полного исчезновения человеческой хромосомы. При этом фрагменты человеческой ДНК, внедрившиеся в геном грызуна (посредством инсерции/транслокации), сохраняются при последующем клонировании, причем даже при культивировании на среде без специфического селективного агента. Присутствие и удерживание человеческой ДНК в хромосомах грызуна далее оценивают с помощью меж-Alu ПЦР, в которой амплифицируются только человеческие последовательности.

32 Гибридизация по Д. Коксу 1990 г

Гибридизация по Д. Коксу 1990 г

Продукты амплификации могут затем быть использованы в флюоресцентной in situ гибридизации (FISH) для подтверждения их хромосомной локализации (Alu-ПЦР кариотипирование). Было показано, что около 90% гибридов содержат человеческую ДНК. Клетки гибридов, содержащих достаточное количество человеческой ДНК, далее оценивают на присутствие или отсутствие ДНК маркеров, обычно с помощью ПЦР, или ДНК/ДНК гибридизации, или др. методов. Метод основан на принципе, что маркеры, близко расположенные друг к другу, скорее будут сохранены или утрачены вместе, чем удаленные. Определяемое расстояние между маркерами является функцией от наблюдаемой частоты разрывов между ними. Эта частота будет различаться в зависимости от применяемой дозы облучения. Расстояние в 1 сантирэй (cR) при данной дозе (например, при 8000 рад - 1 сR8000) соответствует 1% случаев разделения маркеров из общего числа исследованных гибридов. Физически это расстояние составляет около 30-50 килобаз. Для точного картирования маркера на данной человеческой хромосоме необходимо исследовать в среднем 100-200 гибридов.

«Генетический анализ»
http://900igr.net/prezentacija/biologija/geneticheskij-analiz-82566.html
cсылка на страницу

Генетика

16 презентаций о генетике
Урок

Биология

136 тем
Слайды
900igr.net > Презентации по биологии > Генетика > Генетический анализ