Презентация на тему «Как могут меняться размеры растений»

Лекция 2 Генетическая система пластид

Методы обнаружения ДНК в пластидах (краткая история)

Параметры пластидной ДНК. Нуклеоиды – пластидные ядра

Первичная структура ДНК пластид

Генетическая компетентность пластид

Как формируются ткани растений, содержащие хлоропласты

Клетка меристемы ( 15?m )

Клетка мезофилла (65 ?m)

Превращение меристематической клетки ячменя с 10 пропластидами диаметром 1 ?m в мезофильную клетку листа с 65 хлоропластами диаметром 6-8 ?m

Формирование и взаимопревращение пластид

Лейкопласт

Хромопласт

Хлоропласт

Пропластида

Пропластида

Этиопласт

Лейкопласт Хлоропласт Хромопласт запасание фотосинтез окрашивание

Алейропласт Амилопласт Элайопласт

Предыстория…

В конце 18 века итальянец Компаретти: «пластиды – гранулы растительной клетки». 1846 год Нэгели наблюдал деление пластид у водоросли нителла 1858 г. Трекул первый зарисовал пластиды Термин пластиды появился в конце 19 века

История обнаружения ДНК в пластидах Исследование изолированных пластид

1938 – осаждение хлоропластов из листьев шпината, выделено вещество нуклеопротеиновой природы . Начало 50-х годов: в этой фракции были найдены азотистые основания ДНК и РНК в хлоропластах – 0.1-0.2% от сухого веса пластид

Гистохимия 1951-1956

РНК была обнаружена при окраске пиронином в хромопластах моркови и при окраске азуром в этиопластах кукурузы Окраска на ДНК по Фельгену не всегда давала положительный результат Таким образом, гистохимически ДНК не всегда обнаруживалась, что привело к поиску других, более чувствительных методов

Красители: пиронин, метиловый зеленый, азур, краситель Фельгена

1957 г Электронная микроскопия Рут Сэджер у хламидомонады увидела

рибосомоподобные частицы диаметром 100-150 А, позднее они были найдены в хлоропластах высших растений и у других водорослей При предварительной обработке РНКазой частицы не выявлялись

1958 г. Авторадиография – показано включение в пластиды Н3-тимидина

(водоросли Acetabularia), через несколько лет включение Н3- тимидина - в пластиды табака Тритий включается только в пластиды из молодых листьев

1961г. - Совместное применение ЭМ и АВТР (меченые основания) помогло показать синтез ДНК в пропластидах папоротника, а также синтез ДНК+РНК в этиопластах кукурузы

1961 г. Рис и Плаут обнаружили в хлоропластах хламидомонады фибриллы

диаметром 25-30А, исчезавшие при обработке ДНКазой и удивительно напоминавшие бактериальную хромосому. Подобные нити были найдены позднее и у других растений (1962) Электронная микроскопия привела к обнаружению в пластидах ДНК в виде фибрилл и РНК в виде рибосомоподобных гранул

Нуклеоиды хлоропластов – пластидные «ядра»

Dapi-окраска

Cyanidioschyzon merolae – красная водоросль

Фазово-контрастные изображения

Целые клетки

Blue indicates DNA and red indicates the chlorophyll autofluorescence on the thylakoid. cpn, chloroplast nucleoids; mtn, mitochondrial nucleoids; n, nuclei. Bar in (F) = 3 µm for (A) to (F).

Изолированные пластиды

Субфракция хп-нуклеоидов

По крайней мере у некоторых низших водорослей ДНК образует нуклеоиды с

помощью гистоноподобных белков

Одна и та же клетка

Флуоресцентная иммунолокализация белка HC в нуклеоидах пластид

Dapi-окраска

У

Особенности организации растительных нуклеоидов (часть 1)

1. Нуклеоиды – это несколько копий пластидной ДНК, плотно упакованных в большие нуклеопротеиновые частицы 2. Нуклеоиды можно видеть во флуоресцентном микроскопе после окрашивания тканей ДНК-интеркалирующими флуоресцентными красителями, например DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) 3.Число, форма и размеры нуклеоидов варьируют в зависимости от вида: - число нуклеоидов в клетке обычно 5-10 (может быть от 1 до 100) - у водорослей и высших растений описано 5 вариантов формы нуклеодиов – от сферической до кольцеобразной; 4. Количество пластомных копий на нуклеоид зависит от вида растений и от стадии дифференцировки пластид: - пропластиды часто содержат только один нуклеоид; - зрелые пластиды могут содержать более 10-12 нуклеоидов; 5. Нуклеоид и, вероятнее всего, каждая отдельная ДНК-копия, связаны с мембранами пластид: с тилакоидной мембраной и с внутренней мембраной пластиды;

Кольцевые нуклеоиды пластид одноклеточной водоросли Heterosigma

akashiwo

Токсическая водоросль, распространена повсеместно в прибрежной зоне

Особенности организации растительных нуклеоидов (часть 2)

6. Изолированные нуклеоиды сохраняют транскрипционную активность in vitro: это свидетельствует о том, что транскрипционный аппарат тесно связан с ДНК пластид; 7. Совершенно неясно, как контролируется число геномных копий, которые «упаковываются» в один нуклеоид; 8. Обнаружено несколько ДНК-связывающих нуклеоидных белков, самый изученный Н1р - гистоноподобный 9. Число нуклеоидов на клетку определяется ядерными генами; признак может мутировать

В норме у Chlamydomonas ~ 7 нуклеоидов Получены мутанты c резко увеличенным или уменьшенным числом нуклеоидов:

14-23 нуклеоидов

1 нуклеоид мутант MOC

(A) Линейная молекула хпДНК

(B) Два мономера хпДНК – линейный и кольцевой (C) Димер хпДНК (180 µm). (D) Линейные молекулы хпДНК

Хлоропластная ДНК хламидомонады

Каковы молекулы

Хлоропластные ДНК чаще всего - кольцевые (эвглена, 1971). Длина кольца – от 36 до 62 микрон Длина кольца постоянна для каждого вида растений, обычно 44-46 мкм. Обнаруживаются также линейные молекулы, димеры, сцепленные димеры У табака и арабидопсиса обнаружены мультимеры: 6-10 геномных копий

Сколько их в клетке ? Копий пластидной ДНК на органеллу 20-1000 Пластид в клетке несколько сот Число пластидных геномов на клетку – от 2000 до 50000 В хромопластах геномных копий намного меньше В онтогенезе число пластидных ДНК копий может меняться в 10-30 раз .

Максимальные уровни хлоропластной ДНК в листьях на свету

Сравнение пластомов некоторых высших растений, для которых установлена

полная нуклеотидная последовательность

Растение-паразит (не фотосинтезирует)

LSC

IR

19799

22735

Epifagus

virginiana

70028 п.Н.

SSC

4759

IR

22735

Вариации размеров однокопийных районов и инвертированных повторов

хлоропластных ДНК покрытосеменных: Pelargonium hortorum, Spinacia oleracea, Coriandrum sativum

Кориандр

1976 г. – первая физическая карта хлоропластного генома кукурузы

Физическая карта дает представление о размере генома и потенциальной кодирующей способности, но не о конкретных генах

Генетическая карта пластидной ДНК табака -1986 год

Хлоропластная ДНК

Пластидная ДНК сосны

Пластидная ДНК Chlamydomonas

Кольцо показывает гены и ORFs неизвестной функции. Наружное кольцо – гены с известной или предполагаемой функцией

Пластидный геном водоросли Nephroselmis olivacea содержит больше всего

генов – 127

7 генов хп ДНКNephroselmis есть только у этой водоросли: это РНК компонент РНКазы P (rnpB), ген trnS(cga), 5 белок-кодирующих генов

Из них

Гены ycf81 и ftsi раньше обнаруживались только у бактерий

Перечень известных генов некоторых секвенированных геномов

30S субъединица (12 генов из 24 – в пластидной ДНК) rps2 rps3 rps4

rps7 rps8 rps11 rps12i rps14 rps15 rps16i rps18 rps19 50S субъединица (9 генов из 34 – в пластидной ДНК) rpl2I rpl14 rpl16i rpl20 rpl21 rpl22 rpl23 rpl32 rpl33 rpl36

Гены белков рибосом пластид

!

Гены рибосомальных белков пластид собраны в опероны

12 генов пластид собраны в самый большой хлоропластный кластер ctl23

Только немногие пластидные гены транскрибируются моноцистронно (например, psba, rbcL), все остальные по полицистронному типу (как у прокариот)

За 20 лет (1986-2006) полностью секвенировано 58 пластидных геномов:

40 – семенных растений 5 – зеленых водорослей 4 - красных водорослей 9 – других организмов (водоросли, токсоплазмы и пр.)

Генетическая компетентность пластид разных систематических групп

Вид

тРНК гены: 25-35 (17)

рРНК гены: 3-5

Белок-кодирующие гены: 21-133

11

65

Обший размер генома, т.п.н.

ТРНК гены

РРНК гены

Белок- кодирующие гены

Неизвест- ные ORFs

Marchantia polymorpha (1986)

121.024

32

4

55

30

Nicotiana tabacum (1986)

155.844 155.939

30 30

4 5

55 78

30 6

Oryza sativa (1989)

134.525

30 + 3 псевд

4

56

35

Zea mays (1995)

140.387

30

4

70

Epifagus virginiana (1992)

70.028

17 + 5 псевд

4

21

Pinus thunbergii 1994

119.707

32

4

62

Euglena gracilis (1993)

143.170

27

3

51

Более 10

Porphyra purpurea (1995)

191.028

35

3

133

Cyanophora paradoxa (1995)

135.599

33

3

192

192

Odontella sinensis (1995)

119.704

25

3

174

174

РНК-полимераза пластид кодируется четырьмя генами rpo

Гены rpo E.coli гибридизуются с ДНК пластид, что помогло обнаружить и локализовать rpo гены в хпДНК

РНК-полимераза

E. Сoli

Хлоропласт

N и С- части ?'-субъединицы кодируются разными генами

4 субъединицы а2??'

5 субъединиц а2??'?''

rpoA rpoB rpoC1 rpoC2

rpoA rpoB rpoC

Ядерный rbcS

Хлоропластный rbcL

Гены мембран тилакоидов: гены ФС1; (5 генов psa) гены ФС2; (12 генов psb). ген psbА один из наиболее изученных, так как связывается с атразином и др. гербицидами. цитохромный комплекс b/f (5 из 7 кодируются хп геномом) ATФ-синтаза (два комплекса, 5 и 4 субъединицы; хп геном кодирует по 3 субъединицы каждого комплекса).

Гены NADH- дегидрогеназы Выявлены участки, кодирующие посл-ти, гомологичные белкам дыхат. цепи митохондрий. Эти гены активно транскрибируются, но роль их в хп пока неясна. У хп водорослей эти гены не найдены!

РДФК (RBC) - основной белок стромы хлоропластов состоит из одинаковых 8 больших и 8 малых субъединиц. Белок кодируется двумя геномами:

У бурых и красных водорослей оба гена кодируются пластидной ДНК

SS – малая субъединица 12-15 kd

LS – большая субъединица 50-55 kd

Итак, за 50 лет: построены полные карты нуклеотидных

последовательностей хлоропластной ДНК для 88 разных в систематическом отношении групп растений ( год назад – 58!) идентифицировано на этих картах множество генов, относящихся к разным функциональным группам; выяснены особенности группировки этих генов в кластеры.