Перестройки генома в онтогенезе

Лекция 7 Взаимодействие геномов клетки Мутации пластидной и

митохондриальной ДНК

1. Участие генов ядра в репликации и экспрессии пластидной ДНК Р Ретроградная регуляция 2. 3. Механизмы внутриклеточного распределения продуктов ядерных генов 4. Спонтанные мутации органельных геномов И Индуцированные мутации органельной ДНК М Мутации, вызванные ядерными генами-мутаторами 5. Культивирование растений in vitro и мутации

Типы генов в органеллах и у свободноживущих предшественников

Synechocystis

Пластиды

Rickettsia

Митохондрии

Число генов в геноме

Фотосинтез и дыхание

Трансляция

Биосинтез кофакторов

Биосинтез аминокислот

Клеточные процессы

Транспорт.и пермеазы

Метаболизм липидов

Транскрипция

Регулят. функции

Энерг. метаболизм

Биосинтез нуклеотидов

Репликация и репарация ДНК

160

140

120

100

80

60

40

20

0

I - Ядерные гены участвуют в образовании и жизнедеятельности органелл:

Взаимодействие ядерного и органельного геномов – на каждом этапе развития органелл

репликация ДНК органелл осуществляется ферментами ядерного кодирования и специальными белковыми факторами; транскрипция и трансляция осуществляется в большинстве случаев ферментами ядерного кодирования и специальными белковыми факторами ; процессинг, сплайсинг, РНК-редактирование органельных генов выполняют в основном ферменты ядерного кодирования.

ND 7 – 35

RbcL – хпДНК

COB 1 – 10

RbcS - яДНК

COX 3 – 10

ATP 2 – 14

РНК и белки рибосом – совместное кодирование у всех эукариот

мтДНК яДНК

II . Ядерные геномы совместно с органельными кодируют субъединицы белков либо отдельных белков сложных многокомпонентных комплексов:

Пластиды высших растений

Мт животных

Самые яркие примеры

Развитие хлоропластов из пропластид происходит под воздействием

внешних сигналов

Свет

Координированная экспрессия ядерных и пластидных генов

Cхема биогенеза пластид и ядерно-хлоропластного взаимодействия геномов

Ядерные "фотогены" – гены, экспрессия которых зависит от света

Контролируют в основном компоненты фотосинтетического аппарата

При освещении экспрессия их возрастает в 100 и более раз

Мутанты gun (genome uncoupled) c нарушенной ядерно-пластидной координацией экспрессируют ряд ядерных фотогенов в условиях, когда развитие пластид подавлено

При отсутствии света либо полностью блокированы, либо экспрессируются на очень низком уровне

Регулирующая роль ядерных генов в функционировании пластид является

бесспорной. Верно ли обратное – зависит ли экспрессия ядерных генов от процессов, происходящих в пластидах?

Гипотеза:

Пластиды индуцируют какой-то сигнал, необходимый для экспрессии фотосинтетических генов ядра

Что это за сигнал?

Влияние пластид на экспрессию генов ядра

Вероятно, пластидный сигнал формируется с участием какого-то продукта ранней экспрессии пластидного генома (до 48-72 часов от начала прорастания)

Норфлуразон (фотодеструкция хп)

Хлорамфеникол (трансляция)

Тагетитоксин (транскрипция)

Эффект отмечен только при воздействии до 48 часов от начала прорастания

Вещества-ингибиторы

Снижение транскрипции ряда генов ядра (rbcS и др.)

В некоторых случаях пластидный сигнал может регулировать экспрессию

ядерных генов и в отсутствие света

Существуют множественные сигнальные пути от хлоропластов к ядру

Показано, что экспрессия одних генов ядра растений в большей степени изменяется при повреждении пластид по сравнению с другими генами

Природа регуляторных сигналов пока не известна, однако очевидно, что

они воспринимаются

Гено-специфичными элементами промоторов ядерных генов

Ядерный ген N

5‘ UTR

Пластидный сигнал 2

Пластидный сигнал 1

Наиболее детально процесс взаимодействия геномов ядра и митохондрий

изучен у дрожжей

Специфические белки – активаторы трансляции митохондриальных генов, взаимодействуют с 5‘- UTR областями митохондриальных транскриптов

Активаторы выявлены практически для всех мт генов они могут регулироваться внешними факторами, что позволяет адаптировать трансляцию к изменяющимся условиям среды

Ретроградная регуляция:

Ядро

Функциональное состояние митохондрий влияет на экспрессию ядерного генома

Мт

При этом нужно учитывать, что

Количество белков, импортируемых в митохондрии из цитозоля для нормального функционирования клетки – до 4 тысяч

1 2 3 4

Экспрессия одних ядерных генов различается между мутантными штаммами

Экспрессия других ядерных генов не зависит от изменений в мтДНК

4 штамма дрожжей с одинаковым ядерным геномом, но с разным состоянием генома митохондрий

Мт геном потерян

Делеция в 1 гене

Полноценный мт геном

Сохранилось 700пн от всего мт генома

При митохондриальных дисфункциях экспрессия СIT1 не меняется, а СIT2

увеличивается в 30-40 раз. Данная регуляция осуществляется с помощью специальных генов группы RTG.

Изменение экспрессии гена цитратсинтазы СIT2 дрожжей - самый изученный пример ретроградной регуляции

Сit2

75%-ое сходство

Mit СIT

Сit1

СIT1 и СIT2

Древний ген в мт

Перенос гена в ядро

Дупликация гена в ядре

Самая сложная внутриклеточная регуляция экспрессии генов у растений –

3 генома; У двух видов растений: арабидопсиса и бобов - идентифицировали ядерные гены, контролирующие число копий митохондриальной ДНК в клетке; Механизмы ядерно-плазменного взаимодействия - множественные, на всех уровнях экспрессии генома

Несмотря на ряд интересных фактов, понимание взаимодействия геномов клетки у растений находится пока на зачаточном состоянии.

Механизмы внутриклеточного распределения продуктов ядерных генов

Как направляются в митохондрии такие белки?

Более 90% мт белков кодируется ядром и транслируется на цитоплазматических рибосомах

При этом ряд мт белков не имеет в ядре собственных генов, а транскрибируется с тех же матриц, что и цитоплазматические белки

Регуляторные механизмы локализации белков внутри клетки

Первый способ регуляции – более универсальный

При транскрипции гена тРНК-синтетазы образуются две мРНК различной длины

С одной мРНК молекулы – два белка, т.к. два инициирующих кодона

Митохондриальный HTS

Цитоплазматический HTS

Различаются дополнительной последовательностью на 5’ конце – митохондриальный сигнал

Митохондриальный белок Mod5

Ядерный белок Mod5

A.

5’

5’

3’

B.

3’

5’

HTS

3’

MOD5

UTR

AUG(+61)

AUG(+1)

UTR.

AUG(+1)

AUG(+31)

Cпонтанные мутации органельных геномов

Были обнаружены раньше, чем появилась наука о нехромосомной наследственности

Пестролистность – первые описанные спонтанные мутации пластома

Цитоплазматическая стерильность пыльцы – первые описанные спонтанные мутации митохондриального генома

Пестролистность в основном изучалась у родов Antirrhinum и Oenothera

Пестролистные растения в популяции Oenothera появлялись примерно с частотой ~ 0,3% Частота спонтанных мутаций хлорофилл-дефектности в пластоме колеблется у разных видов и составляет в среднем 0.01-1.3%

Пестролистные формы получены для самых разных декоративных видов

растений

Пластидные мутации по своему фенотипическому проявлению делятся на три

основные группы: c нарушениями в световой и темновой фазах фотосинтеза и/или дефектной окраской листьев – от светло-зеленых до белых; с приобретенной резистентностью к гербицидам; с приобретенной резистентностью к антибиотикам

Одноклеточная зеленая водоросль Chlamydomonas -классический объект для

изучения пластидных мутаций в 50-60ые годы

В хлоропластах четырех видов Сhlamydomonas было обнаружено большее разнообразие геномных перестроек, чем описано для более чем 200 видов наземных растений

Рут Сэджер – автор классических работ по хлоропластной генетике Сhlamydomonas

C. reinhardtii, C. smithii, C. eugametos, C. moewusii

Митохондриальные мутации интенсивно изучались на культурах дрожжей,

нейроспоры и других грибов

Были обнаружены несколько классов мутаций: плейотропные мутации - к ним относятся petite – мутации дыхательной недостаточности, а также мутации mit,- имеющие фенотип petite, но сохранившие систему митохондриального белкового синтеза мутации антибиотикоустойчивости

Ядерная ДНК млекопитающих

Ядерная ДНК высших растений

митохондриальная ДНК высших растений

митохондриальная ДНК млекопитающих

Примерно одинакова

~ ~

В 50-100 раз выше, чем у растений

Митохондриальная ДНК покрытосеменных – самая стабильная часть

клеточного генома

Мт хп я

Ядерные ДНК покрытосеменных изменяются в 2 раза быстрее, чем хлоропластные, а хлоропластные в 3 раза быстрее, чем митохондриальные ДНК.

Частота точечных мутаций

Является ли этот феномен результатом более низкой частоты мутирования

или следствием более эффективной репарации возникших замен с сохранением абсолютной идентичности обеих копий?

Пока неясно

Большие инвертированные повторы хлоропластной ДНК отличаются повышенной стабильностью

Частота нуклеотидных замен в этих районах по крайней мере в три-четыре раза ниже, чем в остальных

Почему митохондриальные ДНК высших растений имеют необычно низкий

уровень точковых мутаций ?

Высокая репарационная активность?

Высокая точность ДНК-полимеразы?

Ответа пока нет

Из 281 проанализированных видов покрытосеменных у двух – Pelargonium

hortorum и Plantago rugelii уровень спонтанных мутаций мтДНК оказался в десятки раз выше, чем у всех остальных, приближаясь к таковому в мтДНК позвоночных.

??? ! ! !

Хлоропластные ДНК этих двух видов практически не отличаются от других по уровню спонтанных мутаций, так что эти виды нельзя отнести к быстро эволюционирующим

Структурные перестройки генома

Митохондрии

Хлоропласты

В то время как митохондриальные ДНК высших растений отличаются значительной вариабельностью размеров и структуры молекул, порядок генов в хлоропластной ДНК высших растений почти не изменялся. Так, Marchantia, отделенная от табака по крайней мере 400 миллионами лет эволюции, имеет всего одну инверсию в хлоропластном геноме. Три инверсии отличают хпДНК табака от хпДНК риса (рис.9.1). В то же время, митохондриальный геном двух различных цитоплазм (Т и N) кукурузы, разделенных не более 100 тыс. лет эволюции, различается не менее чем 30 перестройками [Palmer, 1990].

Вариабельность размеров и структуры молекул

Порядок генов в хлоропластной ДНК высших растений почти не изменялся

Nicotiana

Marchantia

Три инверсии отличают хпДНК табака от хпДНК риса

400 млн лет эволюции

Одна инверсия в хлоропластном геноме

В целом, хлоропластный геном эволюционирует по принципу «используй или

избавляйся» “use it or loose it”

Утрата половины пластидного генома бесцветной эвгленоидной водорослью Astasia longa

Малое количество псевдогенов, утрата фотосинтетических генов растениями - паразитами

Мито - склад неиспользуемых последовательностей

В митохондриях Epiphagus сохраняются ряд фотосинтетических генов пластидного происхождения

В то же время в самих пластидах Epiphagus эти гены элиминируются

Горячие точки при структурных реорганизациях органельных геномов

Сравнение структурных мутаций у родственных видов и родов растений показывает, что чаще всего они происходят в определенных местах – так называемых горячих точках (hot spot)

Природа горячих точек не выяснена

???

Возможной причиной горячих точек в хлоропластном геноме являются АТ- богатые области ДНК молекулы

Возможно, они связаны с наличием коротких повторяющихся последовательностей

В митохондриальных геномах самых разных организмов, начиная от дрожжей

и кончая высшими эукариотами, в т.ч. человеком, обнаруживаются крупные делеции

Эти мутации существуют обычно в гетероплазматическом состоянии

Горячие точки при возникновении этих делеций связывают (как и для хлоропластной ДНК) с повторами в митохондриальном геноме

Прямой повтор длиной 13 пар нуклеотидов причинно связан с

возникновением крупной (5 т.п.н.) делеции в митохондриальной ДНК человека

Но! Три из четырех 13-нуклеотидных повторов не связаны ни с какими крупными делециями

13 п.О.

Ааgcccataaaaataaaaattataacaaaccctgaga…………..Actcaaaaccatacctctcacttcaacctccctcacca

L K M L N T N Y H L P P S P L A A *

Индуцированные мутации органельных геномов

Цель индуцирования мутаций органелл:

Понять, как устроены и как экспрессируются органельные геномы

Попытаться решить ряд прагматических задач

Урожайность

Синтез определенных необходимых человеку веществ

Устойчивость к разным стрессам

Индукция органельных мутаций химическими мутагенами

Использовали:

интеркалирующие в ДНК флуоресцентные красители

Антибиотики

Нитрозосоединения

N-нитрозо-N-метил-мочевина (НММ) и N-нитрозо-N-этил-мочевина (НЭМ)

Бромистый этидий и акридины

Оказались наиболее эффективными

Chlorina подсолнечника

мтДНК нейроспора

???

NO O ? ? CH3—N—C—NH2

Мт ДНК крыс

Мт ДНК дрожжей

Реорганизация хлоропластной ДНК у мутантов подсолнечника,

индуцированных нитрозо-метил мочевиной (рестриктный анализ с эндонуклеазой HindIII)

?/Pst ?/HindIII chl1 chl2 chl3 chl5 chl6 chl7 N chl8 chl9 chl10 chl11 chl12 N

Мутации органельных геномов, индуцированные ядерными генами-мутаторами

У разных видов растений описаны природные изоляты, в которых частота пластомных мутаций в сотни и даже тысячи раз превышает спонтанный уровень

Причина: рецессивные ядерные гены, названные генами-мутаторами

Ядро

В гомозиготном состоянии гены-мутаторы вызывают дестабилизацию хлоропластного генома

Возникшие пластидные мутации далее наследуются по материнскому типу и уже не зависят от генотипа ядра

Мутабильность ядерных генов у растений -носителей генов-мутаторов не повышается

Механизм действия генов-мутаторов окончательно не выяснен

Очевидно, происходит нарушение какого-то компонента системы репликации - репарации пластид, кодируемого ядром

Ген chm арабидопсиса, вызывает наследственные изменения не только в

пластидах (пестролистность) но и в митохондриях

Предположение:

Наблюдаемые аномальные митохондриальные фрагменты предсуществовали у растений дикого типа, а гены-мутаторы способствовали их амплификации и вытеснению нормальных молекул

Мутации хлоропластных ДНК при культивировании тканей in vitro

Культура пыльников растений широко используется для получения гаплоидных растений

Хлоропластная ДНК таких альбиносов имеет огромные делеции, иногда до 80% всей молекулы

Условия культивирования каким-то непонятным пока образом провоцируют эти мутации, почему-то именно у злаков

Но у злаков – регенерантов из пыльников очень большая доля альбиносных растений в культуре ( иногда до 80-100%)

Мутации ДНК хлоропластов и митохондрий претерпевают особенно долгий

путь сегрегации, последовательно

На уровне:

Многие возникающие мутации элиминируются на этом пути

Органеллы

Клетки

Целого организма

На сегодня хватит