Вирусы
<<  Вирус ветряной оспы/опоясывающего лишая VZV Социальный проект Акция «Вирус сквернословия  >>
Изучение зараженности клещей нескольких регионов РФ Borrelia
Изучение зараженности клещей нескольких регионов РФ Borrelia
Цели:
Цели:
Задачи:
Задачи:
Обзор литературы
Обзор литературы
Лайм-боррелиоз
Лайм-боррелиоз
Вирусный клещевой энцефалит
Вирусный клещевой энцефалит
Эрлихиоз
Эрлихиоз
Использованные методики
Использованные методики
Пцр
Пцр
Принцип метода ПЦР
Принцип метода ПЦР
Способы детекции результатов ПЦР
Способы детекции результатов ПЦР
Температурный режим:
Температурный режим:
Написанная тест-система для детекции патогенных Ehrlichia spp
Написанная тест-система для детекции патогенных Ehrlichia spp
Результаты и обсуждение
Результаты и обсуждение
Проверка специфичности системы для детекции Ehrlichia spp
Проверка специфичности системы для детекции Ehrlichia spp
Изучение зараженности клещей B. burdorferi, TBEV и Ehrlichia spp
Изучение зараженности клещей B. burdorferi, TBEV и Ehrlichia spp
Выводы:
Выводы:
Благодарности
Благодарности
Литература
Литература
Схема детекции результатов методом TaqMan
Схема детекции результатов методом TaqMan
Пример графиков накопления продуктов амплификации
Пример графиков накопления продуктов амплификации
Секвенирование ДНК
Секвенирование ДНК
Изучение зараженности клещей нескольких регионов РФ Borrelia
Изучение зараженности клещей нескольких регионов РФ Borrelia
Исследованный материал Клещи из трех регионов: Московская область (9
Исследованный материал Клещи из трех регионов: Московская область (9
Экстракция суммарных нуклеиновых кислот
Экстракция суммарных нуклеиновых кислот
Проведение реакции обратной транскрипции (ОТ)
Проведение реакции обратной транскрипции (ОТ)
Проверка чувствительности тест-системы методом «конечных разведений»
Проверка чувствительности тест-системы методом «конечных разведений»
Для статистической обработки полученных результатов исползовалась
Для статистической обработки полученных результатов исползовалась
Постановка реакции секвенирования
Постановка реакции секвенирования
Электрофорез ДНК в агарозном геле
Электрофорез ДНК в агарозном геле
Подбор последовательностей олигонуклеотидов для детекции Ehrlichia spp
Подбор последовательностей олигонуклеотидов для детекции Ehrlichia spp

Презентация на тему: «Изучение зараженности клещей нескольких регионов РФ Borrelia burgdorferi, вирусом клещевого энцефалита и патогенными Ehrlichia spp». Автор: Илья Флямер. Файл: «Изучение зараженности клещей нескольких регионов РФ Borrelia burgdorferi, вирусом клещевого энцефалита и патогенными Ehrlichia spp.ppt». Размер zip-архива: 1571 КБ.

Изучение зараженности клещей нескольких регионов РФ Borrelia burgdorferi, вирусом клещевого энцефалита и патогенными Ehrlichia spp

содержание презентации «Изучение зараженности клещей нескольких регионов РФ Borrelia burgdorferi, вирусом клещевого энцефалита и патогенными Ehrlichia spp.ppt»
СлайдТекст
1 Изучение зараженности клещей нескольких регионов РФ Borrelia

Изучение зараженности клещей нескольких регионов РФ Borrelia

burgdorferi, вирусом клещевого энцефалита и патогенными Ehrlichia spp.

Флямер Илья Научный руководитель: М. А. Турчанинова. ЗАО «НПФ ДНК-Технология» Гимназия на Юго-Западе №1543

2009 год.

2 Цели:

Цели:

Изучить зараженность клещей нескольких регионов РФ трансмиссивными инфекциями: вирусом клещевого энцефалита (ВКЭ), B. burgdorferi и патогенными Ehrlichia spp.

3 Задачи:

Задачи:

Разработать ПЦР-тест-систему для выявления патогенных Ehrlichia spp. Определить с помощью метода ПЦР зараженность клещей ВКЭ, боррелиями и эрлихиями. Проанализировать полученные данные путем сопоставления с имеющимися в литературе данными.

4 Обзор литературы

Обзор литературы

Клещи

Царство: Animalia Тип: Arthropoda Подтип: Chelicerata Класс: Arachnida Подкласс: Acari Надотряд: Parasitiformes Отряд: Ixodida Большинство клещей из семейства Ixodidae — эктопаразиты, переносящие многие заболевания млекопитающих, в частности, человека. Могут переносить сразу несколько инфекций.

Самые распространенные клещи, переносящие инфекции: Ixodes persulcatus, I. ricinus, I. scapularis, I. pacificus, Dermacentor variabilis, Amblyomma americanum, Rhipicephalus sanguineus.

5 Лайм-боррелиоз

Лайм-боррелиоз

Инфицированность клещей: 8-61%. В среднем, 10-11 тысяч случаев за год в России (?6,9 случаев на 100 тысяч человек).

Царство: Bacteria Тип: Spirochaetes Класс: Spirochaetes Отряд: Spirochaetales Семейство: Spirochaetaceae Род: Borrelia Вид (комплекс): Borrelia burgdorferi sensu lato.

6 Вирусный клещевой энцефалит

Вирусный клещевой энцефалит

Группа: Группа IV ((+)ssRNA) Семейство: Flaviviridae Род: Flavivirus Вид: Tick-borne meningoencephalitis virus.

Инфицированность клещей: 1-3% (в отдельные годы - 15-20%). С января по июль зарегистрировано 2264 случая (1,59 случаев на 100 тыс. человек) - рост на 35,6% по сравнению с 2008 годом.

7 Эрлихиоз

Эрлихиоз

Царство: Bacteria Тип: Proteobacteria Класс: Alphaproteobacteria Отряд: Rickettsiales Семейство: Anaplasmataceae Род: Ehrlichia Вид: Ehrlichia chaffeensis, E. muris, E ewingii, E. canis.

Зараженность I. рersulcatus E. muris составляет от 1,4 до 8,5%.

8 Использованные методики

Использованные методики

Экстракция НК фенольным методом. Реакция обратной транскрипции. Real-time ПЦР. Проверка чувствительности тест-системы методом «конечных разведений». Автоматическое секвенирование ДНК по Сэнгеру (методом «терминаторов»). Электрофорез ДНК в агарозном геле. Подбор последовательностей праймеров и пробы для real-time ПЦР.

9 Пцр

Пцр

Суть ПЦР состоит в многократном избирательном копировании определенного участка ДНК при помощи ферментов in vitro.

Компоненты ПЦР: анализируемый образец ДНК праймеры термостабильная (чаще всего – Taq-) полимераза смесь дезоксирибонуклеотидтрифосфатов (дНТФ) буфер.

10 Принцип метода ПЦР

Принцип метода ПЦР

11 Способы детекции результатов ПЦР

Способы детекции результатов ПЦР

После проведения реакции («по конечной точке» - электрофорез, FLASH). Во время реакции («в реальном времени»). Мы использовали флуоресцентно меченые пробы типа TaqMan.

12 Температурный режим:

Температурный режим:

t° Время ПЦР «в реальном времени» мы проводили на амплификаторе ДТ-322 (ЗАО «НПФ ДНК-Технология»).

13 Написанная тест-система для детекции патогенных Ehrlichia spp

Написанная тест-система для детекции патогенных Ehrlichia spp

Написана на ген 16s rRNA, должна детектировать Ehrlichia muris, E. chaffensis и E. canis, а также патогенных бактерий близкородственного рода Anaplasma. Длина ПЦР-продукта – 198 пар нуклеотидов.

14 Результаты и обсуждение

Результаты и обсуждение

Проверка чувствительности имевшихся тест-систем

Проверку делали методом «конечных разведений».

Патоген.

Расчетная чувствительность (число стартовых молекул ДНК на одну амплификационную пробирку)

1,54

TBEV

2,16

B. burgdorferi

15 Проверка специфичности системы для детекции Ehrlichia spp

Проверка специфичности системы для детекции Ehrlichia spp

16 Изучение зараженности клещей B. burdorferi, TBEV и Ehrlichia spp

Изучение зараженности клещей B. burdorferi, TBEV и Ehrlichia spp

Н. Тагил.

Московская область.

Оренбург.

B. burgdorferi

1 (6,6%)

0

10 (11,9%)

TBEV

0

0

0

Ehrlichia spp.

Не изучалось

6 (66,6%)

21 (25 %)

Всего клещей:

19

9

84

17 Выводы:

Выводы:

Освоены методы: подбор последовательностей праймеров и проб, выделение нуклеиновых кислот фенольным методом экстракции, постановка реакции обратной транскрипции, проведение real-time ПЦР с «горячим стартом», электрофореза ДНК в агарозном геле, автоматического секвенирования методом «терминаторов». Разработана тест-система, детектирующая патогенных Ehrlichia spp., встречающихся на территории РФ. Получены данные о зараженности клещей трансмиссивными инфекциями из нескольких регионов РФ. Полученные нами данные сопоставлены с имеющимися в литературе данными.

18 Благодарности

Благодарности

Автор выражает благодарность коллективу ЗАО «НПФ ДНК-Технология» за методическую помощь, всем участникам Оренбургской биологической практики гимназии №1543, помогавшим собирать материал, рецензенту Д. Кнорре за ценные указания и С. М. Глаголеву за организацию практики.

19 Литература

Литература

Спасибо за внимание!

В. В. Малеев. Обзор Европейских рекомендаций по диагностике клещевых бактериальных инфекций. Клиническая Микробиология и Антимикробная Химиотерапия 2005 г. Е. П. Шувалова. Инфекционные болезни. Медицина. 1990 г. C. Kuyler Doyle, Marcelo B. Labruna, Edward B. Breitschwerdt, Yi-Wei Tang, Richard E. Corstvet, Barbara C. Hegarty, Karen C. Bloch, Ping Li, David H. Walker, and Jere W. McBride. Detection of Medically Important Ehrlichia by Quantitative Multicolor TaqMan Real-Time Polymerase Chain Reaction of the dsb Gene. Journal of Molecular Diagnostics. 2005 г. Olga V. Morozova, Andrey K. Dobrotvorsky, Natalya N. Livanova, Sergey E. Tkachev, Valentina N. Bakhvalova, Anatoly B. Beklemishev, and Felipe C. Cabello. PCR Detection of Borrelia burgdorferi Sensu Lato, Tick-Borne Encephalitis Virus, and the Human Granulocytic Ehrlichiosis Agent in Ixodes persulcatus Ticks from Western Siberia, Russia. Journal of Clinical Microbiology. 2002 г. Hui-Min Feng and David H. Walker. Mechanisms of Immunity to Ehrlichia muris: a Model of Monocytotropic Ehrlichiosis. Infection and immunity. 2004 г. Christopher D. Paddock and James E. Childs. Ehrlichia chaffeensis: a Prototypical Emerging Pathogen. Clinical Microbiology Reviews. 2003 г. И. Н. Манзенюк, О. Ю. Манзенюк. Клещевые боррелиозы (болезнь Лайма). Информационно-методическое пособие. ЗАО "Вектор-Бест". 2005 г. А. Д. Амосов. Клещевой энцефалит. Информационно-методическое пособие. ЗАО "Вектор-Бест". 2006 г. Allen G. Rodrigo, Paul C. Goracke, Kiarash Rowhanian, James I. Mullins. Quantitation of Target Molecules from Polymerase Chain Rection-Based Limiting Dilutions Assays. AIDS research and human retroviruses. 1997 г. Rudenko N, Golovchenko M, Cihl?rova V, Grubhoffer L. Tick-borne encephalitis virus-specific RT-PCR--a rapid test for detection of the pathogen without viral RNA purification. Acta Virol. 2004 г. Д. В. Ребриков, Г. А. Саматов, Д. Ю. Трофимов, П. А. Семенов, А. М. Савилова, И. А. Кофиади, Д. Д. Абрамов. ПЦР «в реальном времени». БИНОМ. Лаборатория знаний. 2009 г. Anu J??skel?inen, Xiuqi Han, Matthias Niedrig, Antti Vaheri, and Olli Vapalahti. Diagnosis of Tick-Borne Encephalitis by a ?-Capture Immunoglobulin M-Enzyme Immunoassay Based on Secreted Recombinant Antigen Produced in Insect Cells. Journal of Clinical Microbiology. 2003 г. Интернет-ресурсы: http://www.infectology.ru/nosology/infectious/rikketsiosis/ehrlichioses.aspx http://lib2005.rat-info.ru/files/erlihiozy_i_anaplazmozy.pdf http://www.molbiol.ru/protocol/13_03.html#a2

20 Схема детекции результатов методом TaqMan

Схема детекции результатов методом TaqMan

21 Пример графиков накопления продуктов амплификации

Пример графиков накопления продуктов амплификации

22 Секвенирование ДНК

Секвенирование ДНК

Секвенирование ДНК –определение нуклеотидной последовательности фрагмента анализируемой ДНК. Ферментативное секвенирование по Сэнгеру.

23 Изучение зараженности клещей нескольких регионов РФ Borrelia
24 Исследованный материал Клещи из трех регионов: Московская область (9

Исследованный материал Клещи из трех регионов: Московская область (9

клещей), Свердловская область (Н. Тагил - 19 клещей), Оренбургская область (84 клещей). Клещи из Свердловской области были определены как Ixodes persulcatus.

25 Экстракция суммарных нуклеиновых кислот

Экстракция суммарных нуклеиновых кислот

Гомогенизация клеща в пробирке с помощью специального пестика. Лизис с помощью гуанидина. Выделение фенол-хлороформным методом. Хранение при -20°С.

26 Проведение реакции обратной транскрипции (ОТ)

Проведение реакции обратной транскрипции (ОТ)

Компоненты реакции: ОТ-буфер. ОТ-праймеры (случайные или смесь случайных и специфических 1:10) Ревертаза (обратная транскриптаза) — фермент, осуществляющий реакцию. Исследуемая РНК. Методика: Инкубирование при 40°С в течение 30 мин (синтез кДНК) Прогрев при 95°С в течение 5 мин (инактивация фермента)

27 Проверка чувствительности тест-системы методом «конечных разведений»

Проверка чувствительности тест-системы методом «конечных разведений»

Чувствительность тест-системы – параметр, показывающий, какое число молекул матрицы достаточно для положительного срабатывания теста. 1:10 1:2 1:2 1:2 1:2 1:2

К+ к1

К2

К3

К4

К4

К6

28 Для статистической обработки полученных результатов исползовалась

Для статистической обработки полученных результатов исползовалась

программа Quality (java-версия)

Чувствительность тест-системы

29 Постановка реакции секвенирования

Постановка реакции секвенирования

При проведении это реакции в реакционной пробирке необходимо смешать: Смесь дНТФ, ддНТФ и полимеразы Специальный буфер. Праймер Матрица. Температурный режим: 96°С – 1 мин 96°С – 15 сек 55°С – 10 60°С – 3 мин Для проведения электрофореза для секвенирования использовали секвенатор Genetic Analyzer 3130 (Applied Biosystems)

25 циклов.

30 Электрофорез ДНК в агарозном геле

Электрофорез ДНК в агарозном геле

Электрофорез ДНК — это аналитический метод, применяемый для разделения фрагментов ДНК по размеру (длине).

31 Подбор последовательностей олигонуклеотидов для детекции Ehrlichia spp

Подбор последовательностей олигонуклеотидов для детекции Ehrlichia spp

Для изучения свойств олигонуклеотидов мы использовали программу Oligo 6,31. Последовательности генов мы брали из сервиса GenBank Национального центра биотехнологической информаци, а для поиска сходных последовательностей нуклеотидов использовали сервис BLAST. Синтез праймеров и проб выполнялся отделом синтеза олигонуклеотидов ЗАО «НПФ ДНК- Технология».

«Изучение зараженности клещей нескольких регионов РФ Borrelia burgdorferi, вирусом клещевого энцефалита и патогенными Ehrlichia spp»
http://900igr.net/prezentacija/meditsina/izuchenie-zarazhennosti-kleschej-neskolkikh-regionov-rf-borrelia-burgdorferi-virusom-kleschevogo-entsefalita-i-patogennymi-ehrlichia-spp-162474.html
cсылка на страницу

Вирусы

11 презентаций о вирусах
Урок

Медицина

32 темы
Слайды
900igr.net > Презентации по медицине > Вирусы > Изучение зараженности клещей нескольких регионов РФ Borrelia burgdorferi, вирусом клещевого энцефалита и патогенными Ehrlichia spp