Презентация на тему «Преаналитический этап в коагулологии»

Преаналитический этап в коагулологии

Понятие о коагулограмме и контроле качества проводимых исследований.

Принципы коагуляционных тестов

Клоттинговые: -мануальное определение -автоматическое определение Хромогенные: -двухточечное измерение -кинетическое измерение

Фибриноген повышается при: воспалении (БОФ) гиперлипопротеидемии

сахарном диабете гипертензии ожирении стрессе курении

Принципы коагуляционных тестов

Хромогенный субстрат состоит из короткой пептидной цепи, связанной с красителем (например, pNA). Окрашивание развивается при от-щеплении молекулы красителя от пептидной цепи под действием акти-вированного фактора свертывания. Интенсивность развившейся окраски служит методом оценки активности.

Принципы коагуляционных тестов

Иммунологические: -радиальная иммунодиффузия -электроиммунодиффузия -латексная агглютинация -нефелометрия и турбидиметрия -иммуноферментный анализ -радиоиммуноанализ

Принципы коагуляционных тестов

Молекулярно-генетические исследо-вания для выявления мутаций, от-ветственных за развитие заболева-ний, основанные на методе полиме-разной цепной реакции (ПЦР).(Гемо-филия А, В, болезнь Виллебранда, на-следственный дефицит ATIII, проте-инов C и S, фактора Лейдена, XII).

Антикоагулянт Na3C6 H5 O7

2 H2 O M.м. 294,12 (3,13г/100мл) Na3C6 H5 O7. 5,5 H2 O M.м.357,18 (3,8г/100мл) 0,106 моль/л Цитрат предотвращает коагуляцию за счет связывания ионов кальция.

Взятие образца Кровь берется из периферической (чаще кубитальной) вены

Кровь берется в цитрат в соотношении 1:10 (1 объем цитрата к 9 объемам крови) Неправильное соотношение влияет на результаты теста (концентрация цитрата, разбавление крови)

Разведение более 1:12 (добавление боль-шего объема крови) ведет к

активации свертывания, что проявляется в укорочении времени свертывания. Добавление малого количества крови ведет к большему разведению плазмы и удлинению времени свертывания за счет разведения всех компонентов плазмы и кальция в стандартных реаген-тах.

Ht между 25% - 55% не оказывает существенного влияния на результаты

скрининговых тестов. При Нt более 55% (у новорожден-ных, при полицитемии и др.) отно-шение кровь/цитрат должно быть скорректировано .

Процедура взятия крови

Цель наложения жгута (манжеты) при взятии крови - предотвра-тить обратный ток венозной крови при сохранении кровотока в капиллярах.

Процедура взятия крови

Давление жгута (манжеты) должно быть ниже диастолического примерно на 10 мм. рт.ст. Компрессия более 60 сек. или с из-быточным давлением ведет к ло-кальной активации фибринолиза и возрастанию активности некоторых факторов.

Стаз длительнее 3 минут приво-дит к: укорочению ПВ, АПТВ, ТВ

увеличению примерно на 10% уров-ня фибриногена, АТ III Увеличению примерно на 20% фак-тора Y III:С

Процедура взятия крови

Важно во время взятия крови макси-мально ограничить контактную актива-цию факторов свертывания крови и тромбоцитов. В этом процессе ведущую роль играют смачиваемость поверхности игл и про-бирок. Игла должна быть с широким просве-том, сухая и силиконированная.

Методы взятия: «бабочкообразная» игла - кровь забирается в

силиконизирован-ную стеклянную центрифужную пробирку или пластиковую пробирку, градуированную, содер-жащую антикоагулянт.

Методы взятия: Моноветт(аспирационный ме-тод)- градуированный шприц,

со-держащий раствор цитрата нат-рия (коммерческая система) Вакутейнер (вакуумный метод)-коммерческая система, содержа-щая раствор цитрата натрия

СТАД пробирки - коммерческие пробирки, содер-жащие кроме цитрата

натрия, теофилин, аденозин и дипирида-мол, которые предотвращают активацию тромбоцитов за счет повышения концентрации цАМФ.

СТАД пробирки применяются при: определении факторов тромбо-цитов (PF4,

? -тромбоглобулина) определении гепарина у пациен-тов, получающих гепарин (НФГ и НМГ) - АПТВ и ТВ могут быть ложно нормальными определении ингибитора актива-тора плазминогена (PAI-1)

СТАД пробирки существуют в виде вакутейнеров пробирка после взятия

крови должна немедленно помещаться в ледяную баню образцы должны центрифугиро-ваться в криоцентрифуге (+2о - +8о С) скрининговые тесты могут выпол-няться из СТАД плазмы

Взятие образца Первый мл крови должен быть «выброшен», или для

исследования гемостаза должна быть взята вторая пробирка Кровь должна течь быстро и «са-мотеком» Кровь должна быть перемешана с антикоагулянтом немедленно после взятия

Взятие образца Аккуратная проверка образцов кро-ви позволяет избежать

следующих ошибок: неправильное соотношение кровь/цитрат частично свернувшаяся кровь гемолиз иктерическая или липемическая плазма

Взятие образца Исследование крови из центрально-го катетера должно

проводиться в исключительных случаях. На результаты влияет: мертвое пространство внутри кате-тера с возможным стазом крови активация свертывания на стенке катетера применение инфузионных растворов и гепарина

Взятие образца капиллярной крови (в соответствии со стандартом DIN

58910-D) Чистое и сухое место кончика пальца или ушной мочки пациента пунктируется стерильным скарификатором. Прокол должен быть достаточно глубоким. Недо-пустимо давление или сжатие. Необходимое количество крови (10-50мкл) забирается в стерильный капилляр в тече-ние 10 сек. Капиллярная кровь использу-ется для адаптированных методов.

Центрифугирование крови Цитратная плазма богатая тромбо-цитами -

центрифугирование в тече-ние 5 мин.при 100g (примерно 800 об/мин стандартной центрифуги). Торможение центрифуги должно быть плавное. Супернатант исполь-зуется для исследования функции тромбоцитов.

Центрифугирование крови Цитратная плазма, бедная тромбо-цитами - кровь

центрифугируется 10 мин. при 1500 - 2000g ( около 3000 об/мин) В такой плазме тромбоциты содер-жатся в малых количествах. Используется для большинства тест-ов.

Центрифугирование крови Цитратная плазма, бестромбоцит-ная- плазма

бедная тромбоцитами центрифугируется 20 мин. при 2500 g ( около 4000 об/мин) При необходимости замораживается бестромбоцитная плазма.

Относительная центробежная сила(g) может быть рассчитана с помощью

уравнения или по номограмме. Rcf = 1,118 x 10-5 x r x n2 r - среднее радиальное расстояние от оси вращения в см n - скорость вращения в об./мин. 1,118 х 10-5 -константа, учитываю-щая ускорение силы тяжести

Температурные режимы хранения проб

образцы должны храниться при комнатной температуре, если иссле-дуютя в ближайшее время необходимо избегать повышенных температур хранение в холодильнике(+4оС) ведет к холодовой активации YII, XI, XII факторов

Температурные режимы хранения проб

скрининговые тесты должны быть выполнены в течение 4 часов после взятия крови исследование фактора YIII в тече-ние 2 часов после взятия крови более длительное хранение выдержи-вают факторы II, YII, X , ATIII, про-теин С, кофактор ристоцетина

Температурные режимы хранения проб(при замораживании)

YIII фактор сохраняется: - 2 недели при - 20оС -до 1 года при - 70оС при замораживании/оттаивании вос-производимые результаты наблюдаются, если плазма не содержит фибрин-моно-меров, ПДФ и гепарина (после оттаива-ния удлиняется АПТВ, ТВ и РВ, отрица-тельный тест на РФМК)

Положение тела - влияет на количество форменных элементов,

концентрацию белков, особенно у больных с отеками. Уровень этих параметров выше у пациентов в вертикальном положе-нии. Для получения сравнимых результа-тов образцы крови должны забирать-ся при одном и том же положении тела.

Синтез факторов свертывания начи-нается с 10 недели эмбрионального

периода. Уровень факторов варьирует как у недоношенных, так и доношенных новорожденных. Фибриноген и фактор YIII к рожде-нию достигают уровня взрослого че-ловека, а остальные - в течение 6 ме-сяцев.

Факторы свертывания подвержены циркадным изменениям

Наименьшие концентрации фибри-ногена и других факторов наблю-даются в начале ночи. Другие параметры могут иметь иной биоритм (например, максимум PAI-1 - между 2 и 6 часами ночи), а у ATIII не выявлено суточных колебаний. С учетом возможных колебаний взя-тие крови проводить от 7 до 9 час.утра

Физический и эмоциональный стресс: АПТВ укорачивается концентрация ф

YIII увеличивается концентрация ФВ увеличивается активность t-PA увеличивается скриниговые тесты на фибринолиз становятся патологическими

Диета и гемостаз пища с высоким содержанием живот-ных жиров : ФАК

фрукты и свежие овощи : ФАК Рыбная диета: тромбоциты , фибри-ноген , агрегация тромбоцитов чеснок: фибриноген , агрегация тромбоцитов

Диета и гемостаз дисбаланс кишечной флоры (напри-мер,после

антибиотикотерапии), нару-шение всасывания жиров в кишечни-ке может привести к дефициту вита-мина К кофеин (кофе и т.д.) приводит к увеличению t-PA и снижению актив-ности PAI-1

Диета и гемостаз алкоголь вызывает: АТIII, Ф - сни-жение, PAI-1, t-PA,

кофактор ристо-цитина - возрастание хронический алкоголизм :снижение количества тромбоцитов кокаин : увеличение аграгации тром-боцитов, тромбоцитопения курение:увеличение агрегации, адге-зии, освобождение t-PA, увеличение Ф, снижение активности ф.YII

Лекарства и гемостаз

Анальгетики(индометацин, ибупро-фен, напроксен, фенилбутазон, дикло-фенак) -ингибируют агрегацию тром-боцитов Оральные контрацептивы: снижение ATIII, увеличение агре-гации тромбоцитов Аспарагиназа: снижение Ф, ATIII, Pr.C и S витамин-К зависимых фак-торов, плазминогена

Лекарства и гемостаз

Кровозаменители(декстраны):сниже-ние адгезии и агрегации тромбоци-тов, увеличение ВК, укорочение ТВ и РВ Антибиотики: дефицит витамина К Вальпроевая кислота:тромбоцитопе-ния, снижение Ф, «приобретенный» синдром Виллебранда

НОРМАЛЬНАЯ ПЛАЗМА (НП) (референтная, 100% значения) пул цитратных

бестромбоцитных плазм, полученный от 20 или более клинически здоровых людей, иссле-дованных на отсутствие нарушений гемостаза. Лиофилизированная НП должна быть калибрована производителем против свежей или свежезаморожен-ной НП ( -70о С)

Референтная плазма (100% значения)- централизованно приготовленная

нормальная плазма, критерии и процедура приготовления котор-ой определены в стандарте DIN 58939-1

КАЛИБРОВОЧНАЯ ПЛАЗМА (значения могут отличаться от 100%, но должны

быть точно определены по сравнению с референтной, нормальной плазмами). Используется для многоточечной калибровки. Существует набор калибровочных плазм с различной концентрацией или активностью. Их использование предотвращает разведение факторов.

КАЛИБРОВОЧНЫЕ КРИВЫЕ

Взаимосвязь между временем и активностью чаще нелинейна. Для линейного представления калибро-вочной кривой используются раз-личные системы координат: обратная ( для ПВ) полулогарифмическая(для факторов) факторы калибровки (при использо-вании для определения ATIII методи- ки с хромогенным субстратом)

Гепарины нефракционированный гепарин (НФГ)-смесь фракций с разной

длиной полимерной цепи и имеет м.м. от 3 000 до 30 000 Д низкомолекулярные фракции гепарина (НМГ) имеют м.м. от 3 000 до 7 000 Д

Гепарины Связывание гепарина с АТIII превращает по-следний из медленно

действующего ингиби-тора в очень быстрый ингибитор. НФГ (IIa + ATIII + НФГ) и (Ха + ATIII + НФГ) НМГ не могут надежно образовывать (IIa + ATIII + НМГ) преимущественно блокирует фактор Ха

Схема свертывания крови

Фибриноген фибрин

XII XIIa +Калликреин,ВМК Тканевой активатор

YII

XI

IX + XI a YIIa+ТФ+Са2+ Ca2+

IXa

Са2+ , ф/липиды YIIIa

Xa ca2+ ф/липиды ya

АТ III + гепарин

X

YIII

II IIa

Y

Внутренний механизм Внешний механизм

IIa

IIa

Ап(ч)тв активированное парциальное (частичное) тромбопластиновое время

Отражает изменение активности факторов ВНУТРЕННЕГО пути свертывания крови: YIII, IX, XI, XII, X, Y, II , I Тест чувствителен к ГЕПАРИНУ, ингибиторам

АПТВ К плазме без тромбоцитов добавляют: активаторы контактной фазы

свертывания (каолин, силикаты, эллаговая кислота ) парциальные тромбопластины (фосфолипидная смесь, заменяющая PF 3) хлорид кальция

АПТВ Тест не стандартизован ВОЗ

В качестве заменителя PF3 использу-ют тромбоциты, ФЛ животного проис-хождения(мозг кроликов, быка или человека), растительные ФЛ (сои), смесь растительных и животных ФЛ, ФЛ мембран эритроцитов человека (эрилид, эритрофосфатид). Реагенты отличаются по типу активатора (као-лин, эллаговая кислота, буфер и т.д.)

ПРИЧИНЫ УДЛИНЕНИЯ АПТВ: снижение активности факторов вну-треннего пути

активации свертыва-ния наличие гепарина в пробе наличие в пробе продуктов дегра-дации фибрина/фибриногена (ПДФ) наличие в пробе патологических ингибиторов

Лабораторный контроль НФГ определяется дозами и путем введения

препарата. Дозы менее 20 000 ЕД/сутки считаются профилактическими (200 ЕД/кг/день) - не требуют лабораторного мониторинга.

Лабораторный контроль терапевти- ческих доз НФГ(400-800 ЕД/кг/день)

______________________________ Метод Время взятия АПТВ пациента введения крови АПТВ до введения ______________________________ Перфузия Любое время 2 - 2,5 (НФГ 0,4-0,6 ЕД/мл) В/В 1 час до следую- 1,5 - 2 (НФГ 0,15-0,3 болюсно щей инъекции ЕД/мл) П/К Между 2 инъек- 2 - 2,5 (НФГ 0,4-0,6 2-3 раза/д. циями ЕД/мл )

НМГ (соотношение анти-Ха / анти - IIа) ФРАКСИПАРИН (надропарин

кальцие-вая соль) - 3,5 : 1 ФРАГМИН (дальтепарин натриевая соль) - 2,2 : 1 КЛЕКСАН, ЛОВЕНОКС (эноксапарин натриевая соль) - 3,9 : 1

Контроль за лечением НМГ Допустимо профилактическое назна-чение

препаратов НМГ с учетом массы тела пациента в дозировке, рекомендуемой производителем, без лабораторного мониторинга.

Контроль за лечением НМГ Терапевтическая концентрация НМГ дол-жна

соответствовать определенному уровню анти - Ха активности плазмы (0,2 - 0,4 МЕ/мл). Не осуществляется контроль по АПТВ, т.к. НМГ обладает преимущественно анти-Х-а действием. Оценка анти Х-а активности с использова-нием хромогенного субстрата не входит в международные протоколы.

Мониторинг достигаемых эффектов терапии НМГ -динамика уровня

эндогенной тромбинемии: РФМК тромбин-антитромбиновый комплекс фрагменты протромбина 1+2 Д-димер

Схема свертывания крови

Фибриноген фибрин

XII XIIa +Калликреин,ВМК Тканевой активатор

YII

XI

IX + XI a YIIa+ТФ+Са2+ Ca2+

IXa

Са2+ , ф/липиды YIIIa

Xa ca2+ ф/липиды ya

X

YIII

Арс

II IIa

Y

Внутренний механизм Внешний механизм

ПротеинС +протеин S

Тромбомоду-лин,тромбин

IIa

IIa

АНД препятствуют образованию в гепатоците полноценных

карбоксилированных факторов, образуя PIVKA ( Proteins, Induced in Vitamin K Absence ), у которых снижена способность связывать ионы кальция.

Предшественники фактора свертывания

«Полный» фактор свертывания

Восстановленный витамин К

Эпоксид витамина К

Эпоксидредуктаза витамина К

Варфарин

Активация

Ингибирование

Варфарин обеспечивает более стабильное воздействие на процесс

свертывания крови.

Фенилин токсичен. Пелентан обладает неустойчивым антикоагулянтным эффектом.

Протромбиновое время удлиняется: при заболеваниях печени при приеме

антагонистов витамина К при дефиците витамина К коагулопатии потребления

Тест Квика отражает нарушение активности трех витамин-К зависимых

факторов (YII,X,II), фибриногена и фактора Y Основным реагентом является тромбопластин,содержащий тканевой фактор и фосфолипиды.

ВЛИЯЮТ НА ТЕСТ: тип используемого тромбопластина (полученный из разных

органов и видов животных) тип добавок в реагент (ф.Y,I и антаго-нисты гепарина измерение мануальное или автоматичес-кое использование плазмы или капиллярной крови

ПРОТРОМБИНОВЫЙ ИНДЕКС (ПИ) протромбиновое время нормальной (100%)

плазмы ПИ= х100% протромбиновое время образца

Протромбиновое время в процентах (%) калибровочная кривая используется

для пересчета протромбинового времени пациента в % от нормы (% активности факторов протромбинового комплекса)

ПРОТРОМБИНОВОЕ ОТНОШЕНИЕ (ПО) протромбиновое время образца ПО=

протромбиновое время нормальной (100%) плазмы

МНО определяется как ПО, полученное при использовании тромбопластина,

приготовленного в соответствии с международными стандартами. Необходимо знать его международный индекс чувствительности (International Sensitivity Index, ISI)

Определение МНО

Мич (isi)

ПВ пациента ПВ нормальной плазмы

Мно (inr) =

МНО = Международное Нормализованное Отношение МИЧ = Международный Индекс Чувствительности

Пример расчета МНО Отношение ПВ (РНПлиофил)/ПВсвеж

плазмы =1,14 ПВ (РНП,контроля) =16 сек. ПВ (100%) = 16/1,14 = 14 (сек) ПВ(пациента) = 37 сек. ПО = 37 / 14 = 2,64 МИЧ = 1,2 МНО = 2,641,2 = 3,2

Пример расчета МНО МНО=(ПВ(пац

)/ПВ(РНП)хК)мич К=0,88 ПВ (РНП,контроля) =16 сек. ПВ(пациента) = 37 сек. ПО = 37 / 16х0,88 = 2,63 МИЧ = 1,2 МНО = 2,631,2

Доза варфарина назначается в 17-19 ч. МНО на следующий день не

исследуется. МНО на 2 день и далее исследуется в 9-11ч. Больные имеют высокую, обычную и низкую чувствительность к варфарину, что влияет на применяемую дозу с учетом показаний МНО.

Показания к применению АНД МНО Профилактика и лечение венозных

тромбозов 2,0 - 3,0 Лечение ТЭЛА Инфаркт миокарда Мерцательная аритмия Тканевые протезы клапанов сердца______________________________ Механические клапаны сердца 2,5 - 3,5

Уровни МНО: высокий - МНО от 2,5 до 3,5 средний - МНО от 2,0 до 3,0

низкий - МНО от 1,6 до 2,0 Периоды: нестабильный - до 6 недель от начала приеме АНД стабильный - после 6 недель от начала приема

Элиминация кумаринов из крови у стариков замедлена: МНО следует

поддерживать на уровне 1,4 - 1,7 Кожные некрозы- в первые дни приема варфарина (от 3 до 8 дня)-депрессия протеинаС: тромбируются микрососуды в коже.

Ослабляют эффект АНД Повышенное поступление витамина К с пи-щей

(вегетарианское питание, географические особенности питания) Связывание АНД в кишечнике (холестирамин) Стимуляция активности системы цитохрома Р450 в печени,повышающей метаболизм АНД (медикаменты, хронический алкоголизм) Генетическая резистентность к АНД Снижение катаболизма факторов II,YII, IX, X, протеинов С,S и витамина К (гипотиреоз)

Усиливают эффект АНД Недостаточное поступление витамина К с пищей

Недостаточная абсорбция витамина К в кишечнике (малабсорбция, обструкция желчевыводящих путей) Недостаточная продукция витамина К в кишечнике (антибиотики) Взаимодействие с циклом витамина К (второе и третье поколение цефалоспоринов) Повышение катаболизма факторов II,YII,IX.X, протеинов C,S и витамина К (гипертиреоз)

Коагучек® С Портативный экспресс-коагулометр

АНТИАГРЕГАНТЫ АСПИРИН(ТРОМБОАС и др

) - ингибитор циклооксигеназы (СОХ-1) КЛОПИДОГРЕЛЬ (ПЛАВИКС), ТИКЛОПИ- ДИН (ТИКЛИД) - блокаторы АДФ-рецепторов СУЛОТРОБАН,ПИКОТАМИД - ингибиторы тромбоксансинтетазы ВАНИПРОСТ - блокатор тромбиновых рецепторов REO PRO, ИНТЕГРИЛИН - антагонисты IIb/IIIa рецепторов ИЛОПРОСТ, БЕРАПРОСТ - производные простациклина ТРЕНТАЛ,КУРАНТИЛ -комплексное действие

КОНТРОЛЬ ЗА АНТИАГРЕГАНТНОЙ ТЕРАПИЕЙ ОСУЩЕСТВЛЯЕТСЯ ПО АГРЕГАЦИОННОЙ

ФУНКЦИИ ТРОМБОЦИТОВ. При применении ПЛАВИКСА, ТИКЛИДА - исследуется АДФ_агрегация. При применении аспирина и его аналогов - адреналин-агрегация. Эффективной терапия считается при снижении показателей агрегатограммы в 3-4 раза от исходных цифр.

Биологическая вариация

CVi %-коэффициент внутрииндивидуальной биологической вариации CVG%-коэффициент межиндивидуальной био-логической вариации CVi % CVG% Тромбоциты 9,1 21,9 АЧТВ 2,7 8,6 Протромбиновое время 4,0 6,8 Фибриноген 10,7 15,8 ATIII 5,2 15,3 Фактор YIII 4,8 19,1

Целевые значения В - целевое значение смещения средней ариф-метической

от установленного значения,% CV -целевое значение коэффициента общей аналитической вариации,% + В% +CV% Тромбоциты 8,9 6,8 АЧТВ 3,4 2,2 ПВ 3,4 3,0 Фибриноген 7,2 8,0 ATIII 6,1 3,9 Фактор YIII 7,4 3,6

Предел допустимых значений +В10% +CV10% +В20% +CV20% Тромбо- циты 13,1

11,2 11,9 9,3 АЧТВ 4,8 3,7 4,4 3,1 ПВ 4,8 4,9 4,3 4,1 Фибрино- ген 12,2 13,1 10,7 11,0 ATIII 8,5 6,4 7,8 5,3 YIII ф. 9,6 5,9 9,0 4,9