Презентация на тему «Использование экспериментального и биоинформатического подходов для исследования ретротранспозонов в геномах эукариот»

Использование экспериментального и биоинформатического подходов для

исследования ретротранспозонов в геномах эукариот

Ольга Новикова Новосибирский государственный университет Институт цитологии и гентики СО РАН

Новосибирск 2007

Ретротранспозоны

Используют в процессе своего перемещения обратную транскрипцию.

ORF - открытая рамка считывания 5’UTR и 3’UTR - 5’ и 3’ нетранслируемые районы 5’LTR и 3’LTR - 5’ и 3’ длинные концевые повторы TSD – дуплицированные повторы-мишени

Эволюция ретротранспозонов

Rel-endo ретротранспозоны – non-ltr ретротранспозоны с одной ORF

APE ретротранспозоны – non-ltr ретротранспозоны с двумя ORF

Pseudoviridae

(Ty1/copia)

Metaviridae

(Ty3/gypsy)

+ Bel, DIRS

Retroviridae

Ретротранспозоны: эволюция и распределение

Цель:

Изучение распространения и эволюции ретротранспозонов в геномах эукариотических организмов.

Задачи:

1. Исследование разнообразия non-LTR ретротранспозонов среди представителей отряда Scorpiones (Arachnida: Scorpiones). 2. Исследование разнообразия non-LTR ретротранспозонов среди представителей рода Maculinea (Lepidoptera: Lycaenidae). 3. Определение нуклеотидных последовательностей элементов, относящихся к различным группам non-LTR ретротранспозонов, из видов отряда Scorpiones и рода Maculinea. 4. Обработка последовательностей, изучение внутри- и межвидовой вариабельности, оценка разнообразия групп non-LTR ретротранспозонов в геномах видов отряда Scorpiones и рода Maculinea. Построение филогенетических деревьев non-LTR ретротранспозонов.

Ретротранспозоны: эволюция и распределение

5. Исследование разнообразия LTR ретротранспозонов с помощью биоинформатических подходов в геномах восьми эукариотических организмов, включая три вида грибов (Fungi) и пять видов животных (Animalia). 6. Исследование разнообразия и получение полных последовательностей LTR ретротранспозонов из геномов Aspergillus fumigatus и A. nidulans (Fungi: Ascomycota). Анализ нуклеотидных последовательностей, построение филогенетических деревьев LTR ретротранспозонов. 7. Исследование разнообразия и получение полных последовательностей LTR ретротранспозонов из генома Phanerochaete chrysosporium (Fungi: Basidiomycota). Анализ нуклеотидных последовательностей, построение филогенетических деревьев LTR ретротранспозонов.

Non-ltr ретротранспозоны scorpiones

2 подотряда 10 семейств 21 род 22 вида скорпионов

-

-

Три филогенетические группы были обнаружены в геномах Scorpiones CR1, Jockey и I

Проведен ПЦР-анализ с использованием вырожденных праймеров, клонирование и секвенирование полученных продуктов. Полученные последовательности были использованы для сравнительного и филогенетического анализов

Материал предоставлен Проф. Виктором Фетом (Marshall University, USA)

Non-ltr ретротранспозоны scorpiones

CR1 филогенетическая группа

Jockey филогенетическая группа

I филогенетическая группа

Подавляющее большинство фрагментов элементов представляли собой последовательности нарушенной RT.

Non-ltr ретротранспозоны maculinea

-

-

4 вида: maculinea teleius maculinea nausithous maculinea alcon maculinea arion

Четыре филогенетические группы были обнаружены в геномах Maculinea R4, Jockey, CR1 и R1

Представители рода Maculinea являются мирмекофилами и являются одним из интереснейших объектов изучения для экологов. Относятся к исчезающим видам.

Материал предоставлен Проф. Михалом Войциховски (Jagiellonian University, Poland).

Проведен ПЦР-анализ с использованием вырожденных праймеров, клонирование и секвенирование полученных продуктов. Полученные последовательности были использованы для сравнительного и филогенетического анализов

Non-ltr ретротранспозоны maculinea

R4 филогенетическая группа

Jockey филогенетическая группа

Jockey-подобные элементы обнаружены у всех исследованных maculinea, за исключением M. Arion. Jockey-подобные элементы разнородны, сходство на нуклеотидном уровне составляло в среднем 74%.

R4-подобные элементы обнаружены у всех исследованных Maculinea - семейство MacR4. Элементы MacR4 семейства имеют высокое сходство как внутри видов, так и между видами. Два семейства специфичны для M. arion.

Подавляющее большинство фрагментов R4 и Jockey элементов представляли собой последовательности интактной RT.

Non-ltr ретротранспозоны maculinea

CR1 филогенетическая группа

Три семейства в составе CR1 MacCR1A MacCR1B MacCR1C (T1Q)

R1 филогенетическая группа

Сходство MacCR1A и MacCR1B элементов составляло в среднем 73.5% нуклеотидной последовательности и 88% на аминокислотном уровне.

BLAST анализ показал наличие maccr1b-подобных ретроэлементов в геноме bombyx mori, причем сходство между maccr1b и bmcr1b элементами составляло более 96% на нуклеотидном уровне.

Bmcr1b non-ltr ретротранспозон bombyx mori

Bmcr1b ретроэлемент был реконструирован на основе выравнивания геномных фрагментов B. Mori.

ORF - открытая рамка считывания 5’UTR и 3’UTR - 5’ и 3’ нетранслируемые районы RT - домен обратной транскриптазы APE - домен апурин/апиримидин эндонуклеазы

CR1A и CR1B семейства в геномах lepidoptera

-

-

-

CR1A

CR1B

Для исследования рапределения семейств CR1A и CR1B: Были выбраны 17 представителей отряда Lepidoptera, подотряда Ditrysia, относящиеся к 9-ти семействам. Были выбраны специфичные праймеры для семейств элементов CR1A и CR1B. Проведен ПЦР-анализ, клонирование и секвенирование полученных продуктов.

Материал предоставлен к.б.н. Олегом Костериным (ИЦиГ) и к.б.н. Владимиром Дубатоловым (ИСиЭЖ).

Горизонтальный перенос CR1B элементов

-

-

Критерии: Неравномерное распределение - присутствие у эволюционно далеких видов. Скорость накопления замен в последовательностях мобильных элементов ниже, чем в последовательностях функциональных генов.

Горизонтальный перенос – это процесс, благодаря которому может осуществляться перемещение генов у репродуктивно изолированных видов. Механизм неизвестен.

Горизонтальный перенос 5-10 млн. лет назад

LTR ретротранспозоны в геномах эукариот

UniPro GenomeBrowser - http://genome.unipro.ru/ Plugins - http://genome.sourceforge.net/

Алгоритм HMM (Hidden Markov Model), основанный на скрытых цепях Маркова1 Приложение HMM Search.

Поиск мобильных элементов по заданным характеристикам – наличие прямых или обратных повторов, наличие открытых рамок считывания. Приложение Find ME.

1. Eddy 1998

LTR ретротранспозоны в геномах эукариот

Сaenorhabditis briggsae - 124 HMM сигнала Brugia malayi - 11 HMM сигналов Aedes aegypti - 166 HMM сигналов Ciona intestinalis - 346 HMM сигналов Danio rerio - 210 HMM сигналов

15 новых LTR элементов, относящихся к группам metaviridae, DIRS и bel.

LTR ретротранспозоны aspergillus fumigatus и aspergillus nidulans

Aspergillus nidulans - один из важнейших модельных организмов для исследований биологии клетки и регуляции генов.

Aspergillus fumigatus - основной возбудитель инвазивных микозов. Более 90% случаев.

A. Fumigatus - 60 HMM сигналов A. Nidulans - 25 HMM сигналов

Все элементы - Metaviridae A. fumigatus - 4 группы элементов A. nidulans - 2 группы элементов

A. Fumigatus и A. Nidulans - большинство копий элементов имеют нарушения и замены C:G на T:A

LTR ретротранспозоны aspergillus fumigatus и aspergillus nidulans

Aspergillus fumigatus: Afut1, Afut2, Afut3, Afut4

Aspergillus nidulans: Dane3, Dane4 + Dane1, Dane2

ORF - открытая рамка считывания; 5’LTR и 3’LTR - 5’ и 3’ длинные концевые повторы; RT - домен обратной транскриптазы; RNase H - домен рибонуклеазы Н; Int - интеграза; ССНН и CCHC - цинковые пальцы; Сhromo - хромодомен; * - стоп-кодоны.

3

1

2

1. Neuveglise et al. 1996. 2. Paris S, Latge JP. 2001. 3. Nielsen et al. 2001.

Гомолог-зависимая инактивация повторенных последовательностей грибов

Neurospora crassa - RIP инактивация. Мутагенез, индуцированный повторяющимся последовательностями (RIP – repeat induced point mutations)

Rip-анализ

-

-

-

Подсчет частот встречаемости CpG, TpG, CpA и TpA динуклеотидов. Сравнение частот встречаемости между генами и LTR ретротранспозонами. Реконструкция “de-RIP” элемента.

F[cpg] = o[cpg]/e[cpg], где o[cpg] – наблюдаемое число сайтов cpg в последовательности, e[cpg] – ожидаемое число cpg сайтов, e[cpg]=[c]x[g]/L, где [C] и [G] - число C и G в последовательности, L – длина последовательности

1

1. Galagan and Selker. 2004.

Инактивация LTR ретротранспозонов Aspergillus fumigatus и Aspergillus

nidulans

Сравнительный анализ частот встречаемости CpG, TpA, CpA и TpG сайтов для ретроэлементов и генов показал, что элементы Afut1 и Afut2 из A. fumigatus и Dane4 из A. nidulans подверглись RIP инактивации по CpG и CpA сайтам.

Бокс-плот частот встречаемости CpG, TpA, CpA и TpG сайтов в последовательностях Afut1, Afut2 и генов из Aspergillus fumigatus

Бокс-плот частот встречаемости CpG, TpA, CpA и TpG сайтов в последовательностях Dane4 и генов из Aspergillus nidulans

LTR ретротранспозоны phanerochaete chrysosporium

Phanerochaete chrysosporium - один из немногих грибов-базидиомицетов (basidiomycota), способных разлагать лигнин, главный компонент клеточной стенки растений.

Pseudoviridae - 51 HMM сигнал metaviridae - 144 HMM сигналов

Pseudoviridae - 8 pc_pseudovir элементов metaviridae - 15 pc_metavir элементов

Pseudoviridae - 6 элементов представлены полноразмерными интактными копиями metaviridae - 7 элементов представлены полноразмерными интактными копиями

Pseudoviridae из phanerochaete chrysosporium

Копийность от 2 до 10 и более копий на геном. Гомология между копиями элементов составляла от 85% до 99% нуклеотидной последовательности. Гомология между 5’ и 3’ LTR составляла от 91.2% до 100%. Обнаружены соло LTR (кроме Pc_Pseudovir1 и Pc_Pseudovir2).

Pseudoviridae из phanerochaete chrysosporium

ORF - открытая рамка считывания; 5’LTR и 3’LTR - 5’ и 3’ длинные концевые повторы; RT - домен обратной транскриптазы; int - интеграза; CCHC – цистеиновый мотив; PEP_A3 - протеаза; * - стоп-кодон; TSD - повторы-мишени.

Metaviridae из phanerochaete chrysosporium

Копийность от 1 до 50 и более копий на геном. Гомология между копиями элементов составляла от 82% до 99% нуклеотидной последовательности. Гомология между 5’ и 3’ LTR составляла от 90.4% до 100%. Обнаружены соло LTR Pc_Metavir1,2,3 и 5. Большинство Pc_Metavir относятся к филогенетической группе Chromovirus.

Metaviridae из phanerochaete chrysosporium

ORF - открытая рамка считывания; 5’LTR и 3’LTR - 5’ и 3’ длинные концевые повторы; RT - домен обратной транскриптазы; int - интеграза; PR - протеаза; dutpase - катализирует гибролиз dutp; chromo - хромодомен; CCHC – цистеиновый мотив; * - стоп-кодон; TSD - повторы-мишени.

Metaviridae из phanerochaete chrysosporium

Столь высокое разнообразие LTR ретротранспозонов в геноме одного вида грибов показано впервые. В общей сложности LTR ретротранспозоны составляют около 3% от генома P. chrysosporium.

ORF - открытая рамка считывания; 5’LTR и 3’LTR - 5’ и 3’ длинные концевые повторы; RT - домен обратной транскриптазы; int - интеграза; PR - протеаза; CCHC – цистеиновый мотив; * - стоп-кодон; TSD - повторы-мишени.

Выводы

1. Исследовано разнообразие non-LTR ретротранспозонов в геномах 22-х видов отряда Scorpiones. Показано присутствие трех филогенетических групп non-LTR ретротранспозонов (CR1, Jockey и I) и множественных линий внутри каждой из них. 2. Исследовано разнообразие non-LTR ретротранспозонов в геномах четырех видов бабочек рода Maculinea. Показано присутствие четырех филогенетических групп non-LTR ретротранспозонов (CR1, R1, Jockey и R4) и наличие множественных линий внутри них, в частности, двух близкородственных семейств MacCR1A и MacCR1B внутри филогенетической группы CR1. 3. Обнаружен BmCR1B элемент в геноме Bombyx mori, имеющий высокое сходство с MacCR1B элементом Maculinea. 4. Проведено исследование распределения CR1A и CR1B семейств среди Lepidoptera. Обнаружен горизонтальный перенос CR1B non-LTR ретротранспозонов между представителем семейства Bombycidae и общим предком рода Maculinea более 5 млн. лет назад.

Выводы

5. Исследовано разнообразие LTR ретротранспозонов в геномах восьми эукариотических организмов, включая три представителя царства грибов (Fungi) и пять представителей царства животных (Animalia). Было обнаружено 42 новых, ранее не описанных, LTR ретротранспозонов. 6. Проведен анализ геномов двух аскомицетов, Aspergillus fumigatus и A. nidulans. Для каждого вида было обнаружено по два семейства LTR ретротранспозонов, которые не были описаны ранее. 7. Проведенный RIP анализ убедительно показал, что последовательности LTR ретротранспозонов A. fumigatus и A. nidulans несут отпечатки действия RIP-подобной инактивации. 8. Исследовано разнообразие LTR ретротранспозонов в полной геномной последовательности лигнин-деградирующего базидиомицета Phanerochaete chrysosporium. Было обнаружено 8 новых Pseudoviridae и 15 элементов группы Metaviridae. Столь высокое разнообразие LTR ретротранспозонов в геноме одного вида грибов показано впервые. Большинство обнаруженных LTR ретротранспозонов P. chrysosporium представлены в геноме интактными полноразмерными копиями, которые относительно недавно перемещались. В общей сложности LTR ретротранспозоны составляют около 3% от генома P. chrysosporium.

Финансовая поддержка: Программа Президиума РАН "Происхождение и

эволюция биосферы" №10104-34/П-18/155-270/1105-06-001/28/2006-1 This study was financed by EC within its RTD project “MacMan” EVK2-CT-2001-00126.