Метод гомозиготизации материала в культуре изолированных микроспор ячменя

Метод гомозиготизации материала в культуре изолированных микроспор

ячменя

Работа выполнена в рамках гранта МОН РК по теме: «Технология культуры изолированных микроспор в создании генетически однородных и стабильных сортов ячменя» № гос. регистрации 0112РК02744

Цель исследований:

- Повышение частоты регенерации in vitro сортов ячменя в культуре изолированных микроспор; -Оптимизация параметров культуры клеток и регенерации растений in vitro; - Отработка первичного протокола культуры микроспор ячменя Задачи исследований: - Отбор сортов ячменя для улучшения биотехнологическими методами. Выбор условий для дигаплодизации генотипов ячменя в массовых масштабах. - Цитологические методы определения плоидности растений. - Отработка эффективной технологий ускоренной гомозиготизации генотипов ячменя (культура микроспор). - Разработка культур микроспор выбранных сортов, регенерация растений, удвоение хромосом.

Сбор и подготовка колосьев

9,5-12,5 cм

16-18 cм

1. длина верхнего междоузлия – 16-18 см, длина колоса – 4.5-6.5 см 2. длина верхнего междоузлия – 9,5-12,5 см, длина колоса – 3.5-5 см Рисунок 1.

Культура изолированных микроспор

РИСУНОК 2. Микроспоры: A - свежевыделенные; B - после деления

Развитие из культуры микроспоры

Рисунок 3. 1 – эмбриоидо-подобные структуры (каллусы, эмбриоиды) на питательной среде 2 – меристемати-ческие очаги на регенерационной питательной среде

Развитие из культуры микроспоры

Рисунок 4. 1 – растения на питательной среде для регенерации 2 - доращивание растений-регенерантов в грунте

Таблица 1 – Влияние стадии развития микроспор в пыльниках ячменя на

частоту формирования новообразований на индукционной среде В

Сорта и линии ячменя

Сорта и линии ячменя

Сорта и линии ячменя

Фаза развития микроспор

Фаза развития микроспор

% Пыльников с новообразованиями

% Пыльников с новообразованиями

% Пыльников с новообразованиями

% Пыльников с новообразованиями

Поздняя одно-ядерная

Поздняя одно-ядерная

Ранняя дву-ядерная

Ранняя дву-ядерная

Поздняя одно-ядерная

Ранняя дву-ядерная

Айдын

36

34

0.45 ± 0.84

0.32 ± 0.06

Байшешек

31

35

0.37 ± 0.08

0.20 ± 0.14

Береке 54

39

35

2.74 ± 0.108

0.27 ± 0.03

№275-1

40

42

4.57 ± 0.108

0.41 ± 0.39

175

94

53,7

75

80,5

19

19,5

95

67,4

73,4

64

98,4

2

1,6

97

25

25,8

10

44,1

15

56,8

-

-

24,2

-

22,6

-

22,6

-

-

12,4

-

13,1

-

13,1

Таблица 2 - Влияние источника углеводов на регенерацию растений, сорт Байшешек

Вариант опыта

Вариант опыта

Количество новообра-зований, шт.

Количество новообра-зований, шт.

Частота регенерации

Частота регенерации

Количество зеленых растений

Количество зеленых растений

Количество альбиносов

Количество альбиносов

Штук

%

Штук

%

Штук

%

6% сахароза

6% мальтоза

6% сахароза+ актив. Уголь

Fфакт.

Нср05

Компоненты среды

Мг/л

KCl

1490

MgSO4 x 7H2O

250

CaCl2 x H2O

150

Маннитол (0.3 M)

54 630

pH=7.0

pH=7.0

Таблица 3 – Питательная среда B для предобработки микроспор

Таблица 4 – Питательная среда А для культивирования микроспор

Компоненты среды

Мг/л

KNO3

2830

(NH4)2SO4

463

KH2PO4

400

CaCl2 x2H2O

166

MgSO4 x 7H2O

185

Fe-EDTA

5 мл из 100-x MS

B5-витамины

1 мл из 1000-x стока

B5 микросоли

1 мл из 1000-x стока

Мальтоза

90 000

МЕС буфер

1950

Глютамин

500

pH=6,2

pH=6,2

Оценка плоидности растений-регенерантов

1 2

Рисунок 5. 1- диплоид, 2 – гаплоид

Таблица 5 - Протокол получения дигаплоидов ячменя в культуре

изолированных микроспор

1 этап – Сбор и подготовка колосьев на стадии незрелых соцветий: отбор растений в поздней одноядерной стадии развития микроспор, предобработка изолированных колосьев низкими температурами при +4°+5°C в течение 21-28 суток.

2 этап - Выделение и обработка пыльников: стерилизация колосьев, выделение пыльников на жидкую питательную среду В. Цитологический анализ.

3 этап – Изолирование и очищение микроспор: гомогенизация (300об/мин х 90сек), фильтрация, центрифугирование (900об/м х 3мин), флотирование интактных клеток в градиенте 20% мальтозы, центрифугирование (850об/м х 5мин), смешивание фракции микроспор со средой. Инкубирование эксплантов в темноте 28 дней при 25°C.

4 этап – Деление микроспор и разбавление культуральной среды: после

1-ой недели микроспоры начинают делиться и образуют колонии, каллусы и эмбриоиды. В чашки Петри добавляют среды А с уменьшенным содержанием мальтозы (20 мг/л). 5 этап - Регенерация и укоренение: пассирование эмбриоидоподобных структур на твердую регенерационную среду (MS соли + витамины + 0,1мг/л зеатина + 0,01мг/л гибберелловой кислоты). Через 3-4 недели образовавшиеся растения-регенеранты переносятся на среду для укоренения (1/2 MS соли + витамины + 15 г/л сахарозы). 6 этап – Удвоение хромосом. Контроль уровня плоидности. Пересадка в грунт, опрыскивание раствором ГК. Получение семенного материала. Кариологический и биохимический контроль полученных дигаплоидов.

Продолжение таблицы №5

Методика проведения НИР

- Приготовление питательных сред и стерилизации материала, инструментов по Ф.Л.Калинину и др., 1980. Выделение микроспоры и получение гаплоидов ячменя по методам гаплоидной технологии по А.М.Тураеву и др., 1990; АЦФГР, 1997. Цитоэмбриологические анализы по методике З.П. Паушевой, 1974. Статистическая обработка – В.П.Доспехов 1987;

Объемы работ

- Выращивание донорных растений; - Сбор и подготовка колосьев на стадии незрелых соцветий; - Воздействие холодом (холодовой стресс) пыльников; - Стерилизация колосьев; - Выделение пыльников в асептических условиях; - Подготовка питательных сред; - Изолирование и очищение микроспор; - Наблюдения за делением микроспор; - Перенос эмбриоидоподобных структур на твердую регенерационную среду; - Колхицинирование гаплоидных растений ячменя; - Высадка регенерантов в грунт.

План пропаганды научных достижений

1. Заявление на патент РК на изобретение в РГКП «НИИС» “Способ создания генетически однородных и стабильных дигаплоидных генотипов ячменя на основе культуры изолированных микроспор.” Регистрационный №2013/0085.1 от 29.01.13. Башабаева Б.М., Абугалиева А.И., Исмагул А.Ж. 2. Башабаева Б.М. А.Ж. Исмагул, А.И. Абугалиева, Б.Ш. Алимгазинова, Б.С. Сариев. Культура изолированных микроспор в создании генетически однородных и стабильных дигаплоидных генотипов ячменя //Биотехнология. Теория и практика. Май. 2013.

С п а с и б о з а в н и м а н и е