Исследование
<<  Методы исследования нелинейных САУ Методы этносоциологических исследований  >>
Методы исследования макромолекул
Методы исследования макромолекул
1
1
1. Получение объекта исследования
1. Получение объекта исследования
Центрифугирование
Центрифугирование
2. Обработка объекта
2. Обработка объекта
Основные типы обработкки
Основные типы обработкки
Лизис клеток бактерий (распространенный способ)
Лизис клеток бактерий (распространенный способ)
В основе методов экстрагирования лежит размельчение материала в
В основе методов экстрагирования лежит размельчение материала в
2-3
2-3
Константы седиментации различных частиц
Константы седиментации различных частиц
3. Варианты центрифугирования (для молекул, которые незначительно
3. Варианты центрифугирования (для молекул, которые незначительно
Методы детекции нужных фракций
Методы детекции нужных фракций
3. Варианты экстракции (в зависимости от целей)
3. Варианты экстракции (в зависимости от целей)
4. Выделение суммарных фракций белков
4. Выделение суммарных фракций белков
4. Выделение суммарной фракции нуклеиновых кислот
4. Выделение суммарной фракции нуклеиновых кислот
Целью большинства биохимических исследований является изучение свойств
Целью большинства биохимических исследований является изучение свойств
5. Основные методы детекции белков
5. Основные методы детекции белков
Электрофорез
Электрофорез
Электрофорез молекул
Электрофорез молекул
Варианты гелей
Варианты гелей
Полиакриламидный гель (ПААГ, PAAG)
Полиакриламидный гель (ПААГ, PAAG)
Структура ПААГ
Структура ПААГ
Приготовление геля
Приготовление геля
Разделение белков
Разделение белков
Варианты электрофореза
Варианты электрофореза
Камера для ЭФ
Камера для ЭФ
ЭФ в ПААГ в присутствии ДСН
ЭФ в ПААГ в присутствии ДСН
Использование ЭФ-маркеров
Использование ЭФ-маркеров
Проведение ЭФ в ПААГ с ДСН
Проведение ЭФ в ПААГ с ДСН
Варианты белкового ЭФ
Варианты белкового ЭФ
Двумерный ЭФ
Двумерный ЭФ
ЭФ в ИЭТ
ЭФ в ИЭТ
Изоэлектрофокусирование
Изоэлектрофокусирование
Изотахофорез
Изотахофорез
Диск-ЭФ
Диск-ЭФ
Диск-ЭФ
Диск-ЭФ
Разберем последовательно процесс проведения Диск-ЭФ
Разберем последовательно процесс проведения Диск-ЭФ
Приготовление геля
Приготовление геля
Установка геля
Установка геля
Нанесение пробы
Нанесение пробы
Проведение ЭФ
Проведение ЭФ
Проявка геля
Проявка геля
2. Метод блоттинга
2. Метод блоттинга
Варианты блоттинга
Варианты блоттинга
Вестерн-блот
Вестерн-блот
Вестерн-блот
Вестерн-блот
© Karabelsky A.V. 19
© Karabelsky A.V. 19
© Karabelsky A.V. 19
© Karabelsky A.V. 19
3. Определение концентрации белка в растворе
3. Определение концентрации белка в растворе
Методы выделения и очистки белков
Методы выделения и очистки белков
Фракционирование и концентрирование белков
Фракционирование и концентрирование белков
Методы осаждения
Методы осаждения
Ультрафильтрация
Ультрафильтрация
© Karabelsky A.V. 19
© Karabelsky A.V. 19
Гель-фильтрация (гель-проникающая хроматография)
Гель-фильтрация (гель-проникающая хроматография)
Многообразие гелей для гель-фильтрации
Многообразие гелей для гель-фильтрации
Метод ХРОМАТОГРАФИИ
Метод ХРОМАТОГРАФИИ
Ионообменная хроматография
Ионообменная хроматография
Сорбенты для ионообменников
Сорбенты для ионообменников
Ход ионообменной хроматографии
Ход ионообменной хроматографии
Аффинная хроматография
Аффинная хроматография
Иллюстрация аффинной хроматографии
Иллюстрация аффинной хроматографии
Иммунноаффинная хроматографии
Иммунноаффинная хроматографии
Хроматография на окрашенных адсорбентах
Хроматография на окрашенных адсорбентах
Краситель на поверхности сорбента
Краситель на поверхности сорбента
Распределительная хроматография
Распределительная хроматография

Презентация на тему: «Методы исследования макромолекул». Автор: Shurilo. Файл: «Методы исследования макромолекул.ppt». Размер zip-архива: 3892 КБ.

Методы исследования макромолекул

содержание презентации «Методы исследования макромолекул.ppt»
СлайдТекст
1 Методы исследования макромолекул

Методы исследования макромолекул

© Karabelsky A.V. 19.02.2011

2 1

1

2

3

4

6

5

ОБЩАЯ биохимическая стратегия исследования макромолекул

Получение ОБЪЕКТА исследования (бактерии, дрожжи, клетки тканей)

Э к с т р а к ц и я

Обработка объекта исследования (лизис, разрушение, измельчение)

Выделение нужной фракции или нужной макроструктуры (мембраны, органеллы, ядро, рибосомы, микросомы, цитоплазмы и др.)

Обработка препарата. Выделение фракции белков (липидов, ДНК, РНК и т.д.)

Детекция нужной молекулы

Выделение и очистка нужной молекулы

© Karabelsky A.V. 19.02.2011

3 1. Получение объекта исследования

1. Получение объекта исследования

Культивирование бактерий и дрожжей в “необходимых” условиях. Сбор клеток осуществляется центрифугированием или фильтрацией. Получение ткани животного, человека (или использование культур клеток).

© Karabelsky A.V. 19.02.2011

4 Центрифугирование

Центрифугирование

Клетки хорошо седиментируются при незначительных значениях g. В лабораторных условиях достаточно 5000 об/мин 10-15 минут – чтобы все клетки оказались на дне пробирки.

© Karabelsky A.V. 19.02.2011

5 2. Обработка объекта

2. Обработка объекта

© Karabelsky A.V. 19.02.2011

6 Основные типы обработкки

Основные типы обработкки

Гомогенизатор Поттера Ферментативный лизис Механическое разрушение замороженных тканей (размолом или с помощью вращающихся ножей; под большим давлением; осмотическим шоком; многократным чередованием замораживания и оттаивания )

© Karabelsky A.V. 19.02.2011

7 Лизис клеток бактерий (распространенный способ)

Лизис клеток бактерий (распространенный способ)

Добавляют к клеткам лизоцим, ЭДТА в растворе сахарозы ? растворение наружных мембран. Мембраны превращаются в сферопласты (только внутренняя мембрана) Гомогенизация сферопластов. Вместо гомогенизации можно добавить детергент (если не важна нативность белков). Для выделения плазмидной ДНК можно миновать стадию сферопластов и просто обработать клетки щелочью в присутствии детергента. Крайний вариант – ультразвук. Но в этом случае возможно дробление белка или ДНК(РНК).

© Karabelsky A.V. 19.02.2011

8 В основе методов экстрагирования лежит размельчение материала в

В основе методов экстрагирования лежит размельчение материала в

соответствующем буфере с последующим центрифугированием смеси.

© Karabelsky A.V. 19.02.2011

9 2-3

2-3

Обработка объекта и выделение нужной фракции

© Karabelsky A.V. 19.02.2011

Д и ф ф е р е н ц и а л ь н о е

10 Константы седиментации различных частиц

Константы седиментации различных частиц

© Karabelsky A.V. 19.02.2011

11 3. Варианты центрифугирования (для молекул, которые незначительно

3. Варианты центрифугирования (для молекул, которые незначительно

отличаются по размеру и величине S)

© Karabelsky A.V. 19.02.2011

12 Методы детекции нужных фракций

Методы детекции нужных фракций

© Karabelsky A.V. 19.02.2011

13 3. Варианты экстракции (в зависимости от целей)

3. Варианты экстракции (в зависимости от целей)

1. Если есть опасность действия протеаз – все процедуры проводят на холоду + добавляют стабилизаторы (сахароза, глицерин, ЭДТА) 2. Для выделения суммарной фракции белков мембран можно обработать их детергентами (SDS, тритон x-100). 3. Если цель-это очистка нуклеиновых кислот, то можно добавить к раствору протеазы. Таким образом, избавиться от белков. 4. Для отделения РНК от ДНК – можно добавить фермент, расщепляющий ту или иную кислоту.

© Karabelsky A.V. 19.02.2011

14 4. Выделение суммарных фракций белков

4. Выделение суммарных фракций белков

Один из вариантов выделения суммарных фракций белков – добавление к раствору сульфата аммония до 80% насыщения (высаливание). Возможно добавление детергентов или мочевины, если не важна нативность белка. О процессе высаливания см. дальше.

© Karabelsky A.V. 19.02.2011

15 4. Выделение суммарной фракции нуклеиновых кислот

4. Выделение суммарной фракции нуклеиновых кислот

Основной способ – это обработка смесью фенол-хлороформ. Белки разрушаются и легко отделяются центрифугированием.

© Karabelsky A.V. 19.02.2011

16 Целью большинства биохимических исследований является изучение свойств

Целью большинства биохимических исследований является изучение свойств

различных белков.

Поэтому в дальнейшем будут приведены описания основных методик работы с белковыми препаратами. Будут описаны методы детекции белка в растворе и методы его выделения и очистки.

© Karabelsky A.V. 19.02.2011

17 5. Основные методы детекции белков

5. Основные методы детекции белков

!! 1.Электрофорез 2. Иммуноблоттинг 3. Определение концентрации белка в растворе (колориметрические и спектрофотометрические методы)

© Karabelsky A.V. 19.02.2011

18 Электрофорез

Электрофорез

В основе метода электрофореза лежит миграция макромолекул в электрическом поле. Движение белков обусловлено наличием на их поверхности заряженных радикалов АК ДНК и РНК – заряжены отрицательно всегда

© Karabelsky A.V. 19.02.2011

19 Электрофорез молекул

Электрофорез молекул

Раствор с препаратом помещают в гель (подобный пищевому желе), причем этот гель подобен сетке – со строго определенным размером пор. Гель находится в буфере, через который может проходить ток. При подаче тока молекулы будут двигаться в определенном направлении (в зависимости от своего суммарного заряда) через поры этого геля. Причем более крупные частицы будут двигаться медленнее – так как постоянно будут натыкаться на сетку геля. Через определенное время мы получим разделение молекул по размеру и по заряду.

© Karabelsky A.V. 19.02.2011

20 Варианты гелей

Варианты гелей

Агарозный гель. В основном используется для разделения нуклеиновых кислот. Агароза – чистая фракция природного полисахарида агара. Поставляется в порошках. Гелеобразование происходит после растворения агарозы в буфере, нагревания до кипения и остывании. При остывании нити агарозы за счет водородных связей образуют жгуты. Жгуты перекрещиваются и образуют пористую структуру. Размер пор зависит от исходной концентрации агарозы. (0.8% гель для ДНК-ЭФ)

© Karabelsky A.V. 19.02.2011

21 Полиакриламидный гель (ПААГ, PAAG)

Полиакриламидный гель (ПААГ, PAAG)

Полиакриламид – продукт полимеризации акриламида. Полиакриламидные нити могут быть связаны между собой с помощью молекул N,N’-метиленбисакриламида. После совместной полимеризации получаем структуры с порами. Размер пор зависит от исходных концентраций обоих компонентов.

© Karabelsky A.V. 19.02.2011

22 Структура ПААГ

Структура ПААГ

© Karabelsky A.V. 19.02.2011

23 Приготовление геля

Приготовление геля

Смешивают растворы АА и БисАА в нужном буфере. Добавляют воду, инициатор полимеризации (персульфат аммония) и ускоритель полимеризации (ТEMED)

© Karabelsky A.V. 19.02.2011

24 Разделение белков

Разделение белков

М (кДа) %АА (процент ПААГ) 10-40 15-20 40-100 10-15 100-300 5-10 >300 5

© Karabelsky A.V. 19.02.2011

25 Варианты электрофореза

Варианты электрофореза

Вертикальный (в основном в ПААГ, для разделения белков) Горизонтальный (агарозный гель, разделение нуклеиновых кислот)

© Karabelsky A.V. 19.02.2011

26 Камера для ЭФ

Камера для ЭФ

© Karabelsky A.V. 19.02.2011

27 ЭФ в ПААГ в присутствии ДСН

ЭФ в ПААГ в присутствии ДСН

ДСН (додецилсульфат натрия, SDS)– детергент. Связывается с белками за счет гидрофобных взамодействий и растягивает их. Сульфокислота ДСН делает все белки ОТРИЦАТЕЛЬНО заряженными. Таким образом возможно разделение белков только по их размеру. При этом скорость миграции белка при определенной напряженности электрического поля - величина, зависящая только от размера белка. Ее называют электрофоретической подвижностью.

© Karabelsky A.V. 19.02.2011

28 Использование ЭФ-маркеров

Использование ЭФ-маркеров

В строгих условиях опыта величина электрофоретической подвижности - это постоянная величина. Поэтому при проведении ЭФ можно сравнить ее с подвижностью известных белков (маркёров) с известной молекулярной массой. Таким образом можно определить размер исследуемого белка.

© Karabelsky A.V. 19.02.2011

29 Проведение ЭФ в ПААГ с ДСН

Проведение ЭФ в ПААГ с ДСН

© Karabelsky A.V. 19.02.2011

30 Варианты белкового ЭФ

Варианты белкового ЭФ

Нативный ЭФ (кислый или щелочной) Двумерный ЭФ Электрофорез в ИЭТ Изоэлектрофокусирование Изотахофорез Диск-ЭФ

© Karabelsky A.V. 19.02.2011

31 Двумерный ЭФ

Двумерный ЭФ

1й этап – разделение по размеру в одних условиях. Поворот геля на 90 градусов и проведение ЭФ в других условиях (например в градиенте рН или в буфере с другим рН)

© Karabelsky A.V. 19.02.2011

32 ЭФ в ИЭТ

ЭФ в ИЭТ

рН буфера для ЭФ соответствует ИЭТ (изоэлектрическая точка) исследуемого белка. При подаче напряжения белки с отличной ИЭТ мигрируют к разным полюсам. Нужный белок остается в лунке геля.

© Karabelsky A.V. 19.02.2011

33 Изоэлектрофокусирование

Изоэлектрофокусирование

В этом методе используется градиент рН в постоянной электрическом поле. При этом белки двигаются до тех пор, пока не станут электронейтральными. Есть методы ПРЕПАРАТИВНОГО ИЭФ.

© Karabelsky A.V. 19.02.2011

34 Изотахофорез

Изотахофорез

В этом методе белки разделяются в “Градиенте” напряжения. Каждая белковая зона будет обладать “собственной подвижностью” – в этой зоне будет свое значение напряжения. Граница между зонами четкая. Размер зоны зависит от исходного количетва белка.

© Karabelsky A.V. 19.02.2011

35 Диск-ЭФ

Диск-ЭФ

В одной системе используют два геля разной пористости. Верхний гель служит для концентрирования белковой пробы. Нижний гель – для разделения белков по размеру.

© Karabelsky A.V. 19.02.2011

36 Диск-ЭФ

Диск-ЭФ

Концентрирующий Гель (6%)

Разделяющий гель 7.5-17% или др.

© Karabelsky A.V. 19.02.2011

37 Разберем последовательно процесс проведения Диск-ЭФ

Разберем последовательно процесс проведения Диск-ЭФ

Приготовление пробы. Пробу белка после осаждения, выделения или очистки осаждают 10% ТХУ. Осадок белков растворяют в буфере для проб, который содержит буфер трис-HCl-ЭДТА, глицерин, меркаптоэтанол, бромфеноловый синий и ДСН.

© Karabelsky A.V. 19.02.2011

38 Приготовление геля

Приготовление геля

Сперва в камеру для геля заливают разделяющий гель (например 12% ПААГ). Его готовят на буфере с щелочным значением рН (около 9). После застывания геля сверху наливают раствор концентрирующего геля (обычно 6%), в буфере с рН 6.8. Делают лунки для проб.

© Karabelsky A.V. 19.02.2011

39 Установка геля

Установка геля

Гель устанавливают в камеру и наливают сверху трис-глициновый буфер.

© Karabelsky A.V. 19.02.2011

40 Нанесение пробы

Нанесение пробы

Пробы перед нанесение кипятят 5-10 минут и наносят в лунки геля. В соседние лунки помещают пробу с маркерными белками с известной подвижностью.

© Karabelsky A.V. 19.02.2011

41 Проведение ЭФ

Проведение ЭФ

Сперва ЭФ проходит при 50В (около 10мА). После того, как белки войдут в разделяющий гель – ЭФ проводят при 200-300 В. Белки мигрируют от – к + . Скорость миграции контролируют по степени миграции красителя (он всегда идет первым).

© Karabelsky A.V. 19.02.2011

42 Проявка геля

Проявка геля

После ЭФ гель вытаскивают. Обрабатывают ИПС для фиксации белков в порах геля и помещают в раствор с красителем (обычно кумасси синий) на 1-2 часа. После этого гель отмывают в уксусной кислоте. Белки на геле видны в виде полос синего цвета.

© Karabelsky A.V. 19.02.2011

43 2. Метод блоттинга

2. Метод блоттинга

Существует несколько видов блоттинга. Все они сводятся к тому, что иследуемый образец переносят на нитроцеллюлозный фильтр и помещают этот фильтр в раствор, в котором содержится вещество, способное гибридизоваться с образцом. Места гибридизации видны после специальных методов проявки.

© Karabelsky A.V. 19.02.2011

44 Варианты блоттинга

Варианты блоттинга

Саузерн-блоттинг : перенос ДНК на фильтр (в дальнейшем возможна гибридизация с меченой ДНК за счет комплементарности ? радиоавтография) Нозерн-блоттинг: перенос РНК Вестерн-блоттинг: перенос белков. Обычно проявку белков осуществляют за счет гибридизации белка с антителами. Поэтому этот вид блоттинга называют иммуноблоттингом.

© Karabelsky A.V. 19.02.2011

45 Вестерн-блот

Вестерн-блот

Перенос

© Karabelsky A.V. 19.02.2011

46 Вестерн-блот

Вестерн-блот

Проявка

© Karabelsky A.V. 19.02.2011

47 © Karabelsky A.V. 19

© Karabelsky A.V. 19

02.2011

48 © Karabelsky A.V. 19

© Karabelsky A.V. 19

02.2011

49 3. Определение концентрации белка в растворе

3. Определение концентрации белка в растворе

Колориметрические методы Биуретовый метод – образование в щелочной среде комплекса пептидных связей с ионами меди. 540нм Метод Лоури – Образование комплекса ароматических АК с реактивом Фолина + биуретовая реакция. 750 нм Метод Брэдфорд – основан на связывании с белками красителя кумасси синего, спектр поглощения которого при этом меняется. 595 нм. Спектрофотометрический метод. Основан на способности ароматических АК поглощать УФ свет 280нм. Этот метод используется и для определения концентрации нуклеиновых кислот.

© Karabelsky A.V. 19.02.2011

50 Методы выделения и очистки белков

Методы выделения и очистки белков

Фракционирование и концентрирование. Осаждение Ультрафильтрация 2. Разделение и очистка гель-фильтрация Хроматография

© Karabelsky A.V. 19.02.2011

51 Фракционирование и концентрирование белков

Фракционирование и концентрирование белков

Методы осаждения. Высаливание. Добавление к раствору сульфата аммония до определенной степени насыщения. Осаждение органическими растворителями (ацетоном) Осаждение органическими полимерами (ПЭГ)

© Karabelsky A.V. 19.02.2011

52 Методы осаждения

Методы осаждения

Высаливание

Осаждение органическими растворителями или ПЭГ

© Karabelsky A.V. 19.02.2011

53 Ультрафильтрация

Ультрафильтрация

Препарат с белком прогоняют через мембрану, которая имеет поры определенного диаметра. Белки, размер которых меньше диаметра пор, спокойно через них проходят. Крупные белки при этом концентрируются.

© Karabelsky A.V. 19.02.2011

54 © Karabelsky A.V. 19

© Karabelsky A.V. 19

02.2011

55 Гель-фильтрация (гель-проникающая хроматография)

Гель-фильтрация (гель-проникающая хроматография)

© Karabelsky A.V. 19.02.2011

56 Многообразие гелей для гель-фильтрации

Многообразие гелей для гель-фильтрации

© Karabelsky A.V. 19.02.2011

57 Метод ХРОМАТОГРАФИИ

Метод ХРОМАТОГРАФИИ

-Ионообменная -Аффинная -Иммунноафинная -На окрашенных адсорбентах -Распределительная Все эти методы чаще всего применяются на колонках – колоночная хроматография.

© Karabelsky A.V. 19.02.2011

58 Ионообменная хроматография

Ионообменная хроматография

© Karabelsky A.V. 19.02.2011

59 Сорбенты для ионообменников

Сорбенты для ионообменников

Анионообменники - ионообменная группа DEAE – диэтиламиноэтил. Катионообменники – Карбоксиметильная группа.

© Karabelsky A.V. 19.02.2011

60 Ход ионообменной хроматографии

Ход ионообменной хроматографии

Посадка белка на колонку (в буфере, рН которого отличается от изоточки белка на 0.5-1 в ту или другую сторону) Промывка колонки исходным буфером (при этом несорбированные белки удаляются) Элюция (десорбция) белка, за счет смены буфера. Новый буфер на 1-2 единицы рН отличается от исходного (его рН находится по другую сторону изоточки белка). Белок сходит с колонки. Элюцию можно осуществлять и в градиенте концентрации соли.

© Karabelsky A.V. 19.02.2011

61 Аффинная хроматография

Аффинная хроматография

Метод основан на специфичном взаимодействии белка с некоторыми веществами (рецептор-лиганд, фермент-субстрат, белок-антитело и т.д.) Лиганд изначально сорбирован на колонке. При нанесении пробы он связывается с белком. Элюцию белка можно проводить разными способами. Самый простой способ – резкое изменение рН или высокие концентрации соли.

© Karabelsky A.V. 19.02.2011

62 Иллюстрация аффинной хроматографии

Иллюстрация аффинной хроматографии

© Karabelsky A.V. 19.02.2011

63 Иммунноаффинная хроматографии

Иммунноаффинная хроматографии

Этот метод является вариантом обычной аффинной хроматографией. В качестве лиганда используются специфические антитела.

© Karabelsky A.V. 19.02.2011

64 Хроматография на окрашенных адсорбентах

Хроматография на окрашенных адсорбентах

Хроматография на окрашенных адсорбентах получила широкое распространение, что обусловлено относительной дешевизной и высокой емкостью сорбента. Специфичность адсорбентов, связанных с красителем, такова, что их можно считать аффинными адсорбентами, хотя используемый краситель имеет мало сходства и истинным лигандом. Поэтому этот тип хроматографии часто называют псевдо-аффинной хроматографией. Чаще всего окрашенные адсорбенты используют для очистки нуклеотид-связывающих белков. При низкой ионной силе и относительно низких значениях рН окрашенные адсорбенты являются эффективными катионообменниками, так как благодаря наличию множества отрицательных зарядов они связывают основные белки. В некоторых случаях, адсорбент обладает высоким сродством к белкам, которые не имеют нуклеотид-связывающих центров, например, к альбумину и интерферону.

© Karabelsky A.V. 19.02.2011

65 Краситель на поверхности сорбента

Краситель на поверхности сорбента

F3GA

© Karabelsky A.V. 19.02.2011

66 Распределительная хроматография

Распределительная хроматография

В основе этого метода лежит разделение веществ по их растворимости в различных растворителях. Часто этот метод называют гидрофобной хроматографией. Распространенный вариант - модификация агарозы алифатическими углевородородами. Они создают на поверхности сорбента сильно-гидрофобную среду, за счет чего белки могут залипать своими гидрофобными группами. Элюцию проводят либо просто водой, либо снижением концентрации солей (например сульфата аммония).

© Karabelsky A.V. 19.02.2011

«Методы исследования макромолекул»
http://900igr.net/prezentacija/pedagogika/metody-issledovanija-makromolekul-206230.html
cсылка на страницу

Исследование

11 презентаций об исследовании
Урок

Педагогика

135 тем
Слайды
900igr.net > Презентации по педагогике > Исследование > Методы исследования макромолекул