Сравнительный морфологический и морфометрический анализ плюрипотентных клеток, фибробластов различной плоидности и стабильных гибридов, полученных их слиянием

Сравнительный морфологический и морфометрический анализ плюрипотентных

клеток, фибробластов различной плоидности и стабильных гибридов, полученных их слиянием

Короткевич Екатерина Юрьевна Новосибирский государственный университет Научный руководитель: к.б.н., в.н.с. Киселева Е.В. Институт цитологии и генетики СО РАН 2010 г.

Цель: выявить особенности структурной организации гибридных клеток,

полученных при слиянии эмбриональных стволовых и дифференцированных клеток мыши, а также сравнить строение плюрипотентных клеток мыши в условиях in vivo и in vitro.

Задачи: Провести морфологический анализ эмбриональных стволовых клеток линии E14Tg2aSc4TP6.3, полученной из мышей 129/Ola Mus musculus, и сравнить их с клетками предимплантационных эмбрионов (от зиготы до бластоцисты) для оценки влияния культивирования на ультраструктуру клеток ВКМ. Изучить морфологию ди- и тетраплоидных фибробластов мыши линии DD/c и сравнить их структурную организацию. Сравнить ультраструктуру двух типов стабильных гибридов, полученных в результате слияния ЭСК и ди- или тетраплоидных фибробластов мыши, с родительскими клетками для выявления особенностей реорганизации клеток при взаимодействии геномов плюрипотентной и дифференцированной клеток. Провести сравнительный морфометрический анализ ядерно-цитоплазматического отношения и поверхностно-объемного отношения ядер в плюрипотентных, дифференцированных и гибридных клетках для получения количественной информации об организации клеток с различной степенью дифференцировки.

...

..?..

Дфм

Вкм

ЭСК-подобный гибрид

Эск

Зигота

Бластоциста

Фибробласто-подобный гибрид

Тфм

4. Провести сравнительный морфометрический анализ ядерно-цитоплазматического отношения и поверхностно-объемного отношения ядер в плюрипотентных, дифференцированных и гибридных клетках для получения количественной информации об организации клеток с различной степенью дифференцировки.

2. Изучить морфологию ди- и тетраплоидных фибробластов мыши линии DD/c и сравнить их структурную организацию.

1. Провести морфологический анализ эмбриональных стволовых клеток линии E14Tg2aSc4TP6.3, полученной из мышей 129/Ola Mus musculus, и сравнить их с клетками предимплантационных эмбрионов (от зиготы до бластоцисты) для оценки влияния культивирования на строение клеток ВКМ.

3. Сравнить ультраструктуру двух типов стабильных гибридов, полученных в результате слияния ЭСК и ди- или тетраплоидных фибробластов мыши, с родительскими клетками с целью выявления особенностей реорганизации клеток при взаимодействии геномов плюрипотентной и дифференцированной клеток.

Материалы и методы

Клеточные культуры и ранние эмбрионы мыши: ЭСК – эмбриональные стволовые клетки (линия E14Tg2aSc4TP6.3, получена из мышей 129/Ola Mus musculus) (Pratt, 2000); ДФМ – диплоидные эмбриональные фибробласты (получены из 12.5-дневных эмбрионов мышей линии DD/c Mus musculus); tDD – тетраплоидные фибробласты (получены из ДФМ); tef4 – стабильные гибридные клетки (17 пассажей), полученные при слиянии ЭСК и ДФМ (Круглова, 2008); tef-t8 – стабильные гибридные клетки (28 пассажей), полученные при слиянии ЭСК и ТФМ (Круглова, 2008); эмбрионы – получены из мышей линии 129/Ola (стадия зиготы, 2-х и 4-х клеточного зародыша, морулы, блатоцисты). Используемые в работе клеточные культуры и эмбрионы были любезно предоставлены сотрудниками лаборатории генетики развития ИЦиГ СО РАН к.б.н., н.с. А.А. Кругловой и к.б.н., с.н.с. Е.А. Кизиловой, соответственно.

Методы исследования: -Световая микроскопия полутонких срезов -Просвечивающая электронная микроскопия -Морфометрический анализ

Особенности организации эмбриональных стволовых клеток

Световая микроскопия Окраска метиленовым синим

Электронная микроскопия

10 мкм

50 мкм

2 мкм

Особенности ультраструктурной организации митохондрий в эмбриональных

стволовых клетках

Масштаб 1 мкм

Впервые обнаружено, что ЭСК могут отличаться по морфологии митохондрий. В цитоплазме одних клеток присутствуют митохондрии со светлым матриксом и узкими кристами (Рис. А), в то время как цитоплазма других клеток содержит митохондрии с темным матриксом и расширенными кристами (Рис. Б). Наряду с этим встречаются клетки, в которых присутствуют оба типа митохондрий (Рис. В).

Стадии раннего эмбрионального развития мыши

Д р о б л е н и е

Морула

Бластоциста

Зигота

2-кл

4-кл

1 мкм

Сравнительный морфологический анализ ЭСК и клеток внутренней клеточной

массы бластоцисты

Фрагменты ЭСК

Фрагменты клеток ВКМ

Яд

Я

Яд

Я

М

М

5 мкм

5 мкм

К

М

Ф

М

Эпр

Л

М

Эпр

М

Ф

1 мкм

1 мкм

Сравнительный морфологический анализ ЭСК, диплоидных фибробластов

(ДФМ) и тетраплоидных фибробластов мыши (ТФМ), а также стабильных гибридов, полученных в результате слияния ЭСК с ДФМ, ЭСК с ТФМ.

Масштаб 20 мкм

Диплоидные фибробласты: Вытянутая форма, сглаженная ядерная оболочка, высокая плотность органелл в цитоплазме, расширенные цистерны ЭПР, микрофиламенты под плазмолеммой

Эмбриональные стволовые клетки: округлая форма, крупное слегка изрезанное ядро, низкая плотность органелл в цитоплазме, узкие цистерны ЭПР

Тетраплоидные фибробласты: вытянутая форма, сглаженная ядерная оболочка, высокая плотность органелл в цитоплазме, расширенные цистерны ЭПР, микрофиламенты под плазмалеммой

Фибробластоподобные гибриды: вытянутая форма, глубокие узкие инвагинации ядерной оболочки, высокая плотность органелл в цитоплазме, расширенные цистерны ЭПР, микрофиламенты под плазмалеммой

ЭСК-подобные гибриды: округлая форма, крупное ядро, высокая изрезанность ядерной оболочки, низкая плотность органелл в цитоплазме, узкие цистерны ЭПР

Особенности ультраструктурной организации фибробластов мыши в культуре

М

Эпр

М

Яд

Я

0,5 мкм

Эпр

5 мкм

0,5 мкм

Сравнительный морфологический анализ ЭСК и гибридов, полученных

слиянием ЭСК с диплоидными фибробластами

Эмбриональная стволовая клетка

ЭСК-подобный гибрид

Масштаб 5 мкм

М

Я

Я

Яд

Яд

Сравнительный морфологический анализ фибробластов и гибридов,

полученных слиянием ЭСК с тетраплоидными фибробластами

29 %

Масштаб 5 мкм

Морфометрический анализ ядерно-цитоплазматического соотношения в

гибридных и исходных клетках

Ядерно-цитоплазматическое отношение – отношение площади ядра к площади всей клетки на срезе, проходящем через середину ядра.

Анализ клеток на полутонких срезах проводился с использованием программы AxioVision.

*

*

*

Ядерно-цитоплазматические отношения

Средняя площадь ядра на срезе

Средняя площадь клетки на срезе

Ядерно-цитоплазматический индекс

Площадь ядра, мкм2

Площадь клетки, мкм2

Морфометрический анализ поверхностно-объемного отношения ядер

гибридных и исходных клеток

*

*

Поверхностно-объемное отношение (отношение площади поверхности ядра к его объему) оценивали с помощью тестовой системы линий (открытая квадратная решетка), накладываемой случайным образом на срез клетки, проходящий через середину ядра (Груздев, А.Д.; Weible, E.R., 1969)

Поверхностно-объемное отношение, мкм2/мкм3

Поверхностно-объемное отношение, мкм2/мкм3

Выводы

ЭСК существенно отличаются от клеток ВКМ бластоцисты по строению эндоплазматического ретикулума, отсутствию гранулярных и кристаллических включений, пучков фибрилл в цитоплазме и типу межклеточных контактов. В длительно культивируемых ЭКС мыши впервые обнаружен новый тип митохондрий, который не похож ни на один из многочисленных видов гетерогенной по морфологии популяции митохондрий ВКМ. Тетраплоидные фибробласты сходны по ультраструктурной организации с диплоидными фибробластами и отличается от них несколько большими размерами клетки и ядра. Гибридные клетки, полученные при слиянии ЭСК и диплоидных фибробластов, имеют сходную структурную организацию с ЭСК, тогда как гибридные клетки, полученные слиянием ЭСК и тетраплоидных фибробластов, сходны по морфологии с фибробластами. Оба типа гибридов характеризуются более высокой по сравнению с исходными родительскими клетками изрезанностью ядерной оболочки, к внутренней мембране которой прикрепляется компактный гетерохроматин. Сходство гибридных клеток по морфологическим и морфометрическим параметрам с ЭСК либо фибробластами скорее обусловлено плоидностью соматического партнера.